Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 110
Текст из файла (страница 110)
Если на один виток спирали приходится 10,6 нуклеотнда, то центры изгибов разделяет 9,5 витка (1О1/10,6 = 9,5). Г. Поскольку минимальная подвижность определяется тем, что число витков между центрами изгибов равно половине целого числа (лис-конфигурация), одна и та же бороздка спирали не может оказаться обращенной внутрь в центрах обоих изгибов.
В противном случае, как уже обсуждалось в пункте Б, центры изгиба прв цис-конфигурации были бы разделены целым числом витков. Таким образом, в центрах двух изгибов внутрь должны быъь обращены разные бороздки. Поскольку известно, что в сайте (А,Х,)4 внутри изгиба проходит большая бороздка, (как было сказано в задаче), то участок связывания САР должен быть изогнут так, чтобы в центре изгиба внутрь него была обращена малая бороздка. Латература: Юпйе1, 8.5.; Сгогьегг, О.М.
РХА Ьепд гйгесбоп Ьу рьаге гепйбге ($еГесГ!оп. ХаГпге 328, 178 181, !987. биггеиьегд, М, К.; Сгогьегг, !7. М. !3ХА зег!пеппе десегпппапгг оГ САР-!пдпсег! Ьепббпя апг1 ргоге!и 1йпд!п8 а!7!и!гу. Хагпге 333, 824 — 829, 1988. А, Микрококковая нуклеаза может разрезать лишь ту ДНК, которая не связана с нуклеосомами. Таким образом, ее мишенью служит Клеточное ядро 389 Ряс. 9-35. Схематическое изображе- вве ДНК, связанной с поверх- всстью нуклеосомы, и вызванного этим взаимодействием стеричес- каго препятствия для воздействия ДНКазы 1 !ответ 9-8). Стрелками указано положение фосфодизфир- яых связей, наиболее доступных дзя действия ДНКазы 1.
ДНКааа ! Сайтм раарааамии ДНК атой! Нуклаооома Виа сбоку Виа о торца Б. В. линкерная ДНК, расположенная между нуклеосомами. Чтобы обработка мнкрококковой нуклеазой могла привести к образованию лесенки полос, нуклеосомы должны равномерно располагаться вдоль ДНК, т.е. отрезки линкерной ДНК между нуклеосомами должны быть примерно одинаковой длины. Действительно, лесенка с интервалом, соответствующим разнице в 200 нуклеотидов, свидетельствует о том, что длина линкерной ДНК вместе с длиной нуклеосомной ДНК составляет 200 нуклеотидов.
Если продлить время обработки ядер нуклеазой так, чтобы разрушились большие участки ДНК, то практически каждый линкерный участок будет надрезан, а вся линкерная ДНК расщеплена на небольшие фрагменты. Оставшаяся ДНК (т.е. входящая в состав нуклеосом) должна будет дойти до самого конца геля. На самом деле когда ставят такой эксперимент, то ДНК располагается в зоне, соответствующей длине фрагментов примерно в 140 нуклеотидов. Именно такой размер имеет структура ДНК, уложенной витками вокруг гистонового кора и образующей нуклеосому. Этот результат свидетельствует о том, что длина линкерной ДНК в хроматине из печени крысы составляет примерно 60 нуклеотидов, Как показано на рис. 9-35, если ДНК связана с какой-либо поверхностью, то наиболее доступными фосфодиэфирными связями бу- дут те, что дальше всего отстоят от этой поверхности.
В соответствии с особенностями геометрической структуры сайта связывания ДНКазы 1 лишь верхняя часть спирали будет доступна для расщепления. Возникающая при электрофорезе лесенка полос имеет интервал, соответствующий разности длин фрагментов, равной 10 нуклеотццам, потому что примерно столько нуклеоти- дов приходится на один виток спирали. Следовательно, доступные фосфатные связи будут располагаться с интервалами примерно в 1О нуклеотидов.
Лвтеразурат РгилеИ, Ас КоглЬегд, А,рс Г.иггег, Г.С КГид, Ас Г.ерГГГ, М„ СгтсГУ, Р.о. Репосйсху оГ гГеохупЬоопс!сазе ! ебяезйоп оГ сйгопзайп. Зс!енсе 204, 855 — 858, 1979. Присутствие фракции, устойчивой к нуклеазе, в хроматине, но не в чистой ДНК дает возможность предположить, что у марсианского микроорганизма ДНК входит в состав структур, подобных нуклеосомам, которые и защищают ее от микрококковой нуклеазы. Поскольку при жесткой обработке самый мелкий фрагмент состоит примерно из 300 нуклеотидов, то структура„ подобная нуклеосоме, должна защищать фрагмент ДНК примерно такой длины.
Образование шлейфа при разделении продуктов расщепления свидетельствует о том, что структуры, подобные нуклеосомам, у марсианского микроорганизма не расположены, как у земных организмов, на одинаковом расстоянии друг от друга. Если бы в марсианских клетках нуклеосомы располагались 390 Глава 9 Рвс. 9-36. Схема, иллюстрирующая применение метода непрямого мечения концов для анализа фрагментов разной длины, представленных на рис. 9-9, (ответ 9-10). Участки расщепления микрококковой нуклеазой указаны стрелками, направленными вниз. Небольшой разрыв посередине фрагментов, образовавшихся при обработке нуклеазой, представляет собой участок расщепления ферментом ВащН!. Числа означают длину фрагментов, гибридизующихся с зондом, и соответствуют длинам фрагментов, представленных на рис. 9-9.
Фрагменты, которые после обработки аемН1 гибридизуютсн с зондом 100 Фрагменты. которые после обработки ВагпН! не гибридизуютгд с зондом Зонд 9-10 А. Б, Збо ~ 000 ~а 700 1гао ВамН1 на одинаковом расстоянии друг от друга, то образовалась бы лесенка полос, аналогичная той, что наблюдается при анализе хроматина из печени крысы. При обработке микрококковой нуклеазой образуются фрагменты, длина которых варьирует в зависимости от протяженности участка между нуклеосомами (ею определяются концы фрагментов) (рис.
9-36). Поскольку микрококковая нуклеаза разрезает ДНК не в строго определенных участках внутри линксрной ДНК, то имеется некоторый разброс в длине фрагментов даже при расщеплении между двумя одинаковыми парами нуклеосом. Вместе с тем, при расщеплении нескольких разных пар межнуклеосомных участков могут образоваться фрагменты одинакового размера. Подобная варнабельность мешает точно определить порядок расположе. ния соседних нуклеосом.
После обработки ВшпН1 полосы получаются более четкими потому, что в этом случае один конец каждого фрагмента ДНК точно фиксирован, Как показано на рис. 9-36, лишь фрагменты, лежащие вправо от участка расщепления ферментом ВагпН1, гибридизуются с радиоактивным зондом. Полученные результаты легко интерпретировать, поскольку длина каждого фрагмонта прямо сооз.ветствует расстоянию между участком расщепления нуклеазой и участком разрезания ВатпН1, В варианте без обработки ВашН1 оба конца фрагментов определяются участками расщепления микрококковой нуклеазой. В этом случае нельзя точно определить положение сайта разрезания по отношению к зонду, поскольку при расщеплении нуклеазой нескольких пар участков могут образоваться фрагменты одного размера.
Описанный в этой задаче метод картирования концов, образующихся при обработке нуклеазой, называется методом непрямот о мечения концов, потому что определенный конец (участок расщепления ВагпН1) метится косвенным образом — путем гибридизации с радиоактивно меченным зондом. Размеры фрагментов указывают на расстояние между участками расщепления нуклеазой и участком расщепления ВашН1 (рнс.
9-36). Поскольку микрококковая нуклеаза разрезает ДНК между нуклеосомами, то участки расщепления позволяют определить расположение нуклеосом относительно участка расщепления ВашН! (рис. 9-37). За исключением области вокруг центромеры, сайты разрезания расположены с интервалом в 160 нуклеотидов. Это дает возможность предположить, что нуклеосомы закрывают около 160 нуклеотидов ДНК. Однако участки расщепления по сторонам центромеры отстоят друг от друга на расстояние 250 нуклеотидов; следовательно, центромеру закрывает какая-то особая структура (не нуклеосома).
Полагают, что специальные белки связываются Клеточное ядро 391 Ряс. 9-37. Расположение сайтов раогпеплеиия микрококковой иук- леазой вокруг цеитромеры 1ответ 9.10). Нуклеосомы обозначены груиками. Сайты разрезании микро кок козой нукпеазои сена В Н1 1 т.п.н. Структура хромосомы 9:-11 А. петельные домены Б. хроматиды 1хромосомы) В. кариотип Г. хромосомы типа ламповых щеток Д. политенные хромосомы Е. хромосомные пуфы Ж. активный 3. гетерохроматин 9-12 А, Правильно. с центромерой и защищают ее от действия нуклеазы.
Участки расщепления по сторонам от центромеры показывают, что между центромерой и соседними нуклеосомами находится незащищенная ДНК (аналогичная линкерной ДНК между нуклеосомами). В. Контрольный опыт с очищенной ДНК нужен потому, что не все последовательности ДНК одинаково чувствительны к микрококковой нуклеазе. Важно знать чувствительность каждой изучаемой последовательности ДНК. Иначе можно ошибочно полагать, что появление специфической полосы объясняется связыванием белка рядом с участком расщепления, в то время как на самом деле она зависит от специфичности расщепления нуклеазой. В действительности центромера сама по себе — предпочтительный участок разрезания 1хотя это не показывают результаты по обработке нуклеазой очищенной ДНК, представленные на рис. 9-9).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
