Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 109
Текст из файла (страница 109)
н. В результате обработки каждой из трех рестриктаз, разрезающих молекулу в одном участке, получались две полосы, дающие в сумме 12 т. п, н., следовательно, плазмида должна быть линейной молекулой. Б. Расщепление под действием ВашН1 или ВВП1 приводит к об разованию фрагментов ДНК, содержащих идентичные последовательности (ОАТС) на 5'-концах.
Следовательно, эти фрагменты могут соединшъся во всех возможных сочетаниях. Гибридные участки, образовавшиеся в результате соединения ВашН1-конца и ВВП1-конца (АОАТСС и ООАТСТ), не могут быть разрезаны ни одним из ферментов. Напротив, участки, образовавшиеся при соединении двух ВашН1-концов или двух ВВП)-концов, могут быть разрезаны и тем, и другим ферментом. Следовательно, если присутствуют ДНК-лигаза, ВашН1 и ВдП1, то гомологичные участки, образующие сайт для расщепления ВашН1 или сайт для расщепления ВВП1, снова быстро разрезаются, тогда как гибридные участки, которые не могут быть разрезаны, накапливаются.
Таков способ селективного получения гибридных соединений. Литература: Бтижаь, Х Ис В!асГгЬиги, К ГГ. С!оп!як уеае1 1е1огпегее оп!1пеаг р1аппьй тес!осе. Се11 29, 245-255, 1982 9-5 А. Число повторов в концевом фрагменте должно существенно варьировать. На это указывает широкая полоса, получающаяся при расщеплении рестриктазой А1ц1 вблизи конца мини-хромосомы (наблюдение 6). Если бы число повторов в каждой молекуле было одинаковым, то полоса, содержащая концевой фрагмент, оказалась бы узкой и интенсивной, а не широкой. Отрезок между ведущим и запаздывающим краями этой полосы составляет около 160 п.н., что соответствует примерно 27 повторам. Это и есть масштаб варьирования числа повторов в теломере.
386 Глава 9 Гораздо труднее определить по этим данным среднее число повторов на теломеру, так как остается неизвестным расположение сайта узнавания А!ц1 относительно начала повторов. Однако если расщепление А!п1 происходит точно в начале повторов, то число повторов должно в таком случае варьировать от 60(360/6) до 87(520!6). Полагают, что на одну теломеру приходится около 70 повторов. Повторы ССССАА расположены на 5'-концах отдельных цепей мини-хромосомы. Поскольку синтез ДНК, начинающийся в тандемно повторенной последовательности, постепенно распространяется к центру мини-хромосомы (наблюдение 7), то повторы должны находиться на 5'-концах. Если бы повторы располагались на Зскоицах, то синтез ДНК происходил бы по направлению к концам мини-хромосомы.
Одноцепочечные интервалы в повторах ССССАА по большей части представляют собой пропуск одного нуклеотида. Поскольку при денатурации высвобождаются одноцепочечные фрагменты (наблюдение 4), то должны быть разрывы в фосфодиэфирном Б В скелете. Вероятно, этн разрывы содержат ЗсОН, поскольку онн служат сайтами для синтеза ДНК (наблюдения 1, 3 и 7), однако они не могут быть простыми разрывами 5ЬРОе с 3'-ОН, так как обработка мини-хромосомы лигазой не приводит к снижению включения нуклеотицов ДНК-полимеразой (наблюдение 2). Природу этих одноцепочечных разрывов можно выявить, если произвести замещение свободных 5сфосфатов мечеными фосфатамн и затем разрушить все связи с пуриновыми нуклеотидами, что приведет к образованию преимущественно фрагмента ССС (наблюдение 5).
Этот результат указывает на то, что большинство разрывов представляют собой пропуски одного нуклеотида, а именно первого С(5сС)-повтора. (Если бы был пропущен ЗАС в последовательности — ССС вЂ” АА —, то метка по 5'-фосфату присоединялась бы к А, а фрагмент ССС оказался бы немеченым.) Длина разрыва скорее всего не больше размера одного нуклеотн- да, так как ДНК-полимераза может включать меченый С в отсутствие других нуклеотидов (наблюдение 1). (Если бы разрыв соответствовал, например, двум нуклеотидам, то первым нуклео- гидом, встроенным ДНК-полимеразой, был бы А.) В связи с тем что при денатурации теломеры образуются одно- цепочечные фрагменты, соответствующие 2, 3 и 4 повторам ССССАА (наблюдение 4), одноцепочечный разрыв может в среднем встречаться один раз на каждые два-четыре повтора.
Эти результаты показывают, что строение теломеры в рибосомной мини-хромосоме соответствует показанному на рис. 9-33. В этой модели учтены все экспериментальные данные. Г Д Экзоны в гене !3-глобина человека соответствуют положениям, где наблюдается гомология с кДНК; последняя представляет собой Рас. 9-33. Часть концевого повтора рнбоеомной мини-хромосомы. Указано положение специфических пролуснов одного нуклеотнда (отает 9-5). ССССААССССААССССААССССААСССАА н он а-а-а-а-т-т-а-а-а-а-т-т~-а-а-а-т-т~а-а-а-а-т-т-а-а-а-а-т-т 3' 3 3 о-г Латературас В!аеггЬигп, Е. Ос Са!1, Х С.
А сапгСслс!у гсреассд негрсеасе ас сЬе !сгнил! ог сЬе ехсгасЬгоеюколи! лЬокогла! ВЬ1А Копен 1а Теггаьутела. 1. Мо!. Вьз. !20, 33 — 53, 1978. Клеточное ядро 387 А. ЭКЗОНЫ В ГЕНЕ РГЛОБИНА ЧЕЛОВЕКА б. ГОМОЛОГИЯ ГЕНОВ ЧЕЛОВЕКА И МЫШИ й В к а' к О~ Ъ к е в о Д м х от к в Д я б' Ген В.елобина человека 520Е2 нуклеотида2 3' 3' Ген д тлобинакеловека Рес. 9-34. Точечные матрицы, показывающие расподожсппо экзо- Вов в гене б-гдобппа человека (А) В соотношение между гомодогич- Вымп последовательностями мыши а эхзопамп гепа человека (Б) (ответ Вб). Эхзопы представлены в виде прямоутольппхов, светлая часть щтормх соответствует пеходпрую- шам последовательностям па 5'- и у-копцах. 25* непосредственно копию мРНК и, следовательно, не содержит интронов. Интроны соответствуют областям, расположенным между экзонами.
Положения интроиов и экзонов в гене В-глобина человека показаны на рис. 9-34, А. Б. Судя по положениям экзонов, указанным на рис. 9-34,А, первые два экзона в гене 53-глобнна человека гомологичны соответствующим последовательностям в гене )3-глобииа мыши (рнс. 9-34, Б).
Однако в третьем экзоне лишь первая половина его гомологична последовательностям гена В-глобина мыши. В гомо- логичной части третьего экзона содержатся последовательности, кодирующие белок, тогда как негомологичная часть представляет собой нетранслнруемую 3'-область гена. Поскольку эта часть гена не кодируот белок (а также не содержит протяженные области регуляторных последовательностей), она эволюционирует примерно с той же скоростью, что и интроны. В. 5'-области генов б-глобина человека и мыши также гомологичны, что видно по скоплению точек вокруг той же диагонали, на которую приходится скопление точек для первого экзона (рис.
9-34, Б). Эти области соответствуют регуляторным областям, расположенным перед точками начала транскрипции генов. В связи с тем что данная область несет регуляторные функции, возможности ее изменений в ходе эволюции ограничены, подобно тому как они ограничены по причине кодирующей функции в случае экзонов. Функциональные последовательности, испытывающие давдение отбора, дивергируют значительно медленнее, чем последовательности, не имеющие определенных функций.
Г. Исходя из точечной матрицы, представленной на рис. 9-5, Б, можно заключить, что первые интроны имеют примерно одну и ту же длину в генах мыши и человека, однако вторые интроны у них значительно различаются по длине. Если бы эти ннтроны имели одинаковую длину, то линейные сегменты, представляющие собой гомологичные области, лежали бы на одной и той же диагонали. Самый простой способ выявить подобную колинеарность — это наклонить страницу и посмотреть вдоль диагонали.
На основе представленного сравнения невозможно определить, с чем связано 388 Глава 9 изменение длины: с укорочением интрона у мыши или же с удлинением интрона у человека. Лптература: Коп!геЬ !7.А.; Ма!ге!, А К; телег, Р. ТЬе его1пбоп апг! ееяпепее согпрапзоп ог Гво гесеппу г!!гегке8 пюпее сЬгогпогогпа! /1-81оЬ!и 8епег. Се!1 18, 865 — 873, 1979.
уганя, Я. Ап ьзгегасвче ягарбясе ргоягагп Еог согпрапп8 апг! а)!8п!п8 ппс!ек ас!г! апг! апппо асгкй ееяпепсек Хпс!е!с Ас!г!г Кек !О, 2951 — 2961, !982. 9-7 А. В том случае, когда относительная подвижность минимальна участки связывания САР отстоят друг от друга на расстояние 85 нуклеотидов (рис. 9-6,В). Если на один виток приходится 10,6 нуклеотида, то данное расстояние соответствует 8 виткам спирали (857'10,6 = 8).
В случае максимальной относительной подвижности САР-связывающие участки отстоят друг от друга на расстояние 79 нуклеотидов, что соответствует 7,5 виткам спирали. Б. Два САР-связывающих участка должны быть изогнуты совер- шенно одннаково,так как они идентичны. Следовательно, в обоих этих участках в центре изгиба должна оказаться одна и та же бороздка, обращенная вовнутрь. Чтобы ДНК изогнулась с образованием цис-конфигурации, два центра связывания должны быть на одной и той же стороне спирали. Большие бороздки (или малые бороздки) располагаются на одной и той же стороне спирали, если в промежутке между центрами изгибов укладывается целое число ее витков. Таким образом, можно ожидать, что минимум относительной подвижности (г7ис-конфигурация) будет соответствовать тому, что расстояние между центрами изгибов равно целому числу витков спирали.
Аналогичным образом максимальная относительная подвижность (вгранс-конфигурация) будет достигнута, когда центры изгиба находятся на противоположных сторонах спирали, т.е. когда количество витков между центрами изгибов равно половине целого числа. В. В случае минимальной подвижности конструкции с одним участ- ком связывания САР и одним участком связывания (А,Х,),, центры изгибов разделены 10! нуклеотндом (рис. 9-6,Г).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
