Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 113
Текст из файла (страница 113)
Б. Если активируется каждая точка начала репликацин, то за каждый цикл репликации число копий генов хорионических белков будет удваиваться. Таким образом, для 60-кратного увеличения должно пройти шесть циклов репликации 12а = 64). В. Чтобы стимулировать избыточную репликацию кластера генов, кодируюших белки хориона, контролирующий амплификацию элемент, размер которого составляет 510 нуклеотидов, должен находиться в точке начала репликации. Однако этот элемент не может представлять собой обычную точку начала репликации; вием должны также содержаться последовательности, которые на определенных стадиях развития фолликулярных клеток препятствуют блокаде повторной репликации.
Поскольку механизм блокады неизвестен, .Трудно строить предположения о том, из-за чего он мог бы не сработать. Однако представляется вероятным, что белки фолликулярных клеток, специфичные для определенных стадий развития, связываются с точкой начала реплнкации или вблизи нее, в результате чего этот сайт сохраняет свою активность.
Может также оказаться, что сама по себе эта точка начала репликации нечувствительна к блокаде повторной репликации, но активна лишь в фолликулярных клетках, находящихся на определенной стадии развития Гподобно встроенной в хромосому точке начала репликацин ЯЧ40, которая «молчит» в отсутствие Т-антигена; см, задачу 9-20). С другой стороны, эта точка начала репликации может быть активна во всех тканях, но становиться нечувствительной к блокаде повторной репликации, взаимодействуя со специфическим белком, присутствующим в фолликулярных клетках. 888 Глава 8 Литературте Огт-цтеаоег, Т, Вс Яргат)11пд, А.
С. 17тахоргт1!а с!тот!оп капе атрййсвйоп тойгйтее ап прв1тоип ге81оп тейп!в!1пк в18 1гапеспр1юп. ЫВ1. Сей. Вю!. 6, 4624 — 4633, 1986. 9-22 3„3„ "Легкие" молекулы л Лереый цикл репликеции 32р зн 3!,! 32р Молекулы, промежуточные по плотнооти Второй цикл реппикеции 32р 3!.т Молекулы, промежуточные же плотнаоти згр згр "Тлжелые" молекулы Ряс. 942. Схема меченяя цепей ДНК (ответ 9-22).
Синтез и нроцессинг РНК 9-23 А. РНК-полимераза Б. фактор инициации В. факторы элонгации Г. РНК-полимераза П; РНК-полимераза 1; РНК-полимераза 1П А. Три пика в градиенте плотности представляют собой 1в направлении от «легкого» пика к «тяжелому») нереплицированную ДНК, ДНК, реплицированную один раз, и ДНК, реплицированную дважды (рис. 9-42). Инъецированная ДНК помечена 'Н, но во всех остальных отношениях это нормальная «легкая» ДНК.
Каждая новосинтезированная цепь включает метку 32Р и БУДР, который увеличивает ее плотность. Следовательно, после одного цикла репликации ДНК будет обладать промежуточной плотностью и содержать одну «легкую» цепь, меченную Н, и одну «тяжелую», меченную 3'Р. После второго цикла репликации из гибридной ДНК образуются один дуплекс, гибридный по плотности, н один дуплекс, содержащий две «тяжелые» цепи, меченные '2Р. «Полностью тяжелый» дуплекс расположен в самой плотной обласп~ градиента. Поскольку «полностью легкая» ДНК не реплидировалась, в ней не будет содержаться "Р, а так как «полностью тяжелая» ДНК содержит две новые цепи, в ней не будет присутствовать 'Н.
Образование дискретных пиков в этом эксперименте имеет приндипиальное значение„так как показывает, что мечение связано главным образом с репликацией, а не с репаративным синтезом, Если бы включение метки было связано с репаративным синтезом, который осуществляется мозаично, то метка распределилась бы по всему градиенту, а не собралась в дискретных пиках. Б. Инъедируемая ДНК имитирует ожидаемое поведение хромосомной ДНК в одном важном отношении: за один клеточный цикл она проходит только один цикл репликации. Об этом можно судить по отсутствию «полностью тяжелой» ДНК после прохождения одного клеточного цикла.
Однако в другом отношении поведение инъецированной ДНК значительно отличается от поведения клеточной ДНК: большая фракция инъецированной ДНК не реплицируется даже после двух клеточных циклов. Отсутствие репликации проявляется в сохранении «полностью легкого» пика ДНК. Неясно, почему часть инъецированной ДНК не реплицируется. Возможно, некоторые клетки при использовании данной методики становятся некомпетентными. В. Поскольку циклогексимид подавляет белковый синтез, он не должен прямо действовать на синтез ДНК. И действительно, в присутствии диклогексимида один цикл репликации завершается нормалъно, но после этого репликация прекратцается.
Вероятно, циклогексимид подавляет следующий клеточный цикл потому, что ключевые события в этом процессе зависят от синтеза белка. Важно, что ДНК не реплицируется повторно, пока клетка ие пройдет весь дикл. Литература: Лат)апт), Я.М.; ьаткеу, Я.А. Веяп!В!ой терйсвбоп о1 !ЭАТА пт)сто)в!ос!ой тп1о е884 о1 Хеларттл 1аеоеь Сей 21, 761-771, 1980. Клеточное ядро 399 Д.
факторы транскрипции Е. ТАТА-фактор; ТАТА-бока Ж.транскрипционная единица 3. гетерогенная ядерная РНК (гяРНК) И. матричная РНК (мРНК) К. 5'-кэп Л. ро!у(А)-взвоет» М. первичный транскрипт РНК Н. сплайсинг РНК О. гяРНП (гетерогенный ядерный рибонуклеопротеин) П. мяРНП (малые ядерные рибонуклеопротеины) Р. 5'-сайт сплайсинга, 3'-сайт сплайсинга С. сплайсосома Т. синдром талассемии У. ядрышко Ф, яцрышковый организатор 9-24 А. Неправильно. Факторы инициации и элонгации не присутствуют постоянно в составе фермента.
Они временно соединяются с ферментом на стадии инициации или элонгатшн синтеза РНК. Б. Неправильно. РНК-полимеразы 1, 11 и 1П структурно похожи друг на друга, и некоторые субъединицы у них общие„но другие уникальны. В. Правильно. Г. Правильно. Д. Неправильно. 3'-конец большинства транскриптов, синтезируемых РНК-полимеразой 11, определяется не точкой терминацин транскрипции, а сайтом расщепления цепи РНК, который находится через 10 — 30 нуклеотидов после последовательности АА11ААА. Е.
Правильно. Ж. Правильно. 3. Неправильно, Как частицы гяРНП, так и частицы мяРНП состоят из многих полипептндных цепей, образующих комплекс с РНК. Однако частицы гяРНП содержат мРНК, которая весьма нестабильна. И. Неправильно. Несмотря на то что интронные последовательности в основном удаляются, они должны быть вырезаны очень точно, поскольку ошибка даже на один нуклеотид приведет к сдвигу рамки считывания в образовавшейся молекуле РНК и сделает бессмысленной всю матрицу. К.
Правильно. Л. Правильно. М. Неправильно. 28$-рРНК, 188-рРНК н 5,88-рРНК транскрнбируются как части одного большого предшественника-458-РНК, который затем разрезается с образованием одной копии каждой из трех рРНК. Образование этих трех рРНК из одного первичного транскрипта гарантирует, что они будут синтезированы в одинаковых количествах.
Н. Неправильно. Рибосомные РНК упаковываются вместе с рибосомными белками в ядрышке. О. Правильно. П. Правильно. Р. Неправильно. Интерфазные хромосомы стремятся занять в интерфазном ядре определенные области, и маловероятно, что они сильно переплетены с другими хромосомами. 400 Глава 9 9-25 А. На дорожке 4 отсутствует транскрипт размером 400 нуклеотндов (рис. 9-20), так как в реакционной смеси присутствовал ОТР. ОТР обеспечивает возможность того, чтобы транскрипция продолжалась дальше последовательности, не содержащей С, в результате чего образуются транскрипты размером более 400 нуклеотидов. В отсутствие ОТР (дорожка 2) транскрипция не может продолжаться за пределами не содержащей С последовательности (С-минус).
В присутствии ОТВ и РНКазы Т1 (дорожки 6 и 8) более длинные транскрипты расщепляются у первого О с образованием транскрипта размером 400 нуклеотидов. Б. Одна из трудностей, возникающих при изучении функциониро вания промотора ш 911го, связана с высокой фоновой неспецифической инициацией транскрипции. Именно этот фон так сильно проявляется на дорожке 3.
Причины его возникновения до конца не ясны, однако транскрипция может начинаться и с последовательностей в остальной части плазмиды, имеющих некоторое сходство с настоящими промоторами РНК-полимеразы 11. В. Транскрипт размером 400 нуклеотидов присутствует на дорожке 5 потому что в результате расщепления РНКазой Т1 он высвобождается из любых случайно инициированных транскриптов, считывание которых проходило через последовательность С-минус. Фактически он на несколько нуклеотидов длиннее, чем специфически инициированный транскрипг, так как его 5'-конец определяется первым О, который предшествует последовательности С-минус. Транскрипт размером 400 нуклеотндов отсутствует на дорожке 7, поскольку 3'-О-метил-ОТР приводит к терминации большинства транскриптов, инициируемых перед последовательностью С-минус. Комбинавагя 3'-О-метил-ОТР и РНКазы Т1 фактически приводит к исчезновению всего фонового синтеза с контрольной плазмиды.
Г. Определение специфической транскрипции в грубых зксграктах (то есть в присутствии ОТР) не должно представлять особых трудностей. Как показано на рис. 9-20 (дорожки 7 и 8), специфическую транскрипцию можно определить в присутствии О-нуклеотндов, если в реакционную смесь добавлены 3'-О-метил-ОТР н РНКаза Т1 (для подавления фоновой транскрипции и расщепления всех случайных транскриптов на мелкие фрагменты). Лптература: хап аноде, Мс Яоеггег, й.
6. Расгогз 1пто1те4 ьч зрес16с ггепзспрпоп Ьу Ьшпап йХА ро!угпегазе 11: апа1уйз Ьу а гарЫ апд чпапгйагпе гп ыгго аззау. Ргос. 1ча11. Аса($. Бей 13БА 82, 4394-4398, 1985. 9-26 А. Эффективность транскрипции, рассчитанная для области плато, составляет 7,2 х 109 транскриптов на одну реакцию. Действительно, в ходе реакции включается 2,4 пмоль СМР, и длина каждого транскрипта составляет 400 нуклеотидов, из которых 200 нуклеотидов приходится на СМР. Транскрипты 2,4 пмоль СМР 6 х 10" СМР х х Реакция Реакция моль моль х х 10гз пмоль Транскрипт х 200 СМР = 7,2 х 10з транскрипт!реакция. Клеточное ядро 401 Б. В одной реакции участвует 1,0 1О" матриц.
При концентрации 16 мкг/мл в 25 мкл реакционной смеси содержится 0,4 мкг матрицы (16 х 0,025 = 0,4). Каждая матрица содержит 3500 пар нуклеотидов (п. н.). Матрицы 0,4 мкг 6 х 10" Да п.н. Матрица х х х Реакция Реакция мкг 660 Да 3500 п. н. = 1,0 10" матрица!реакция.
В. На одну матрицу приходится около 0,07 транскриптов, что эквива лентно примерно одному транскрипту РНК на 14 матричных молекул: Транскрипты 7,2 х 10' транскриптов х Матрица Реакция Реакция = 0,07 транскрипт!матрица. 1,0 х !О" матриц Низкая эффективность вашей реакции типична для транскрипции гп вчгго. Соотношение 1 транскрипт на 14 матриц не обязательно свидетельствует о том, что в синтезе РНК участвует 1 из 14 матричных молекул. Может оказаться, что на гораздо меньшем числе матриц синтезируется большое число транскриптов. Например, на одной из 140 матричных молекул может сннтезироваться 10 транскриптов.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
