Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 116
Текст из файла (страница 116)
Подобная гибридизация с зондами, лишенными определенных последовательностей !безбалластная, или субтрактивная гибридизация), делает зонд более специфичным н позволяет исключить из анализа большой класс клонов кДНК„ Контроль генной экспрессии 4ОЭ которые, как вы предполагаете, не содержат искомого гена, Клоны класса А содержат кДНК, соответствующие видам РНК общим для трех типов клеток: 1ОТ1!2, индуцнрованных и нормальных миобластов.
В этом классе содержатся все обычно присутствующие в клетках гены «домашнего хозяйства». Это и есть тот класс клонов, который должен быть удален в результате субтрактивной гибридизации. Поскольку зонды 2 и 3 гибридизуются лишь с 1% клонов кДНК, выявляемых зондом 1, РНК, соответствующие генам домашнего хозяйства, должны составлять большую часть всех видов мРНК, присутствующих в клетках.
Клоны класса В содержат молекулы кДНК, соответствующие тем молекулам РНК, которые были индуцированы обработкой 5-аза-С, но отсутствуют в нормальных миобластах н в клетках 10Т1!2. Поскольку 5-аза-С приводит к деметилированию, то неудивительно, что это вещество активирует некоторые гены, которые в норме в миобластах не экспрессируются.
Клоны класса С содержат кДНК, соответствующую той РНК, которая присутствует в нормальных миобластах, но отсутствует в миобластах, обработанных 5-аза-С. Если бы индуцнрованные миобласты были идентичны нормальным миобластам, такого класса клонов просто не существовало бы. Можно было бы подозревать в индуцированных миобластах какой-то изъян, однако, по-видимому, все дело в популяции нормальных мнобластов.
Последняя содержит небольшую фракцию полностью дифференцированных миотрубочек, которые отсутствуют в популяции нндуцированных миобластов. Таким образом, РЫК, выделенная из популяции нормальных миобластов, включает и РНК клеток более дифференцированных типов. При анализе было обнаружено, что клоны класса С кодируют продукты генов, специфичные для мышц, такие, как тропонин 1, а также тяжелая и легкая цепи миозина. В клонах класса Р содержится кДНК, соответствующая РНК, специфичной для миобластов. Именно в этих клонах вы надеетесь обнаружить ген-регулятор, контролируюгций дифференцировку миобластов.
Реально ген, контролирующий, по-видимому, дифференцировку миобластов (глуоР1), был обнаружен как раз в клонах этого класса. Он был идентифицирован с помощью тестов, основанных на следующих предположениях: 1) ген-регулятор не должен экспрессироваться вообще в клетках 10Т1/2; 2) его экспрессия должна достигать максимума в мнобластах; 3) его экспрессия должна снижаться в миотрубочках и 4) он не должен экспрессироваться в таких клетках 10Т1/2, которые не дифференцируются после обработки 5-аза-С, На последней стадии этих экспериментов клонированная кДНК была введена в клетки 10Т112 и заставила эти клетки дифференцироваться в миобласты. Убедительное доказа- тельство! Лятератураг Оачгп Я.Ь.г ИетггаиЬ, Н.; Ьгигаг, А.В.
Ехргем1оп оГ а яп81е ггапзГесгсй СОХА сопчега ВЬгоЫаегз го гпуоЫаза. Сеп 51, 987 — 1000, 1987. Контроль инициации транскрипции 10-6 А. промотор Б. репрессор лактозного оперона 410 Глава 10 В. репрессор; негативный контроль Г. позитивный; активатор гена Д. активатор катаболизма Е. сигма-фактор Ж. ТАТА-фактор (фактор транскрипции 11В, ТР11Р); транскрипционньгй комплекс 3. элемент, расположенный перед промотором И, энхансер 10-7 А.
Неправильно. Аллолактоза связывается с репрессором лактозного оперона. Когда концентрация аллолактозы становится достаточно высокой, она связывается с репрессором н вызывает такие аллостерические изменения конформации, которые приводят к ослаблению связи репрессора с ДНК, тем самым обеспечивая возможность транскрипции, Б. Правильно. В. Правильно. Г. Неправильно. Действие на расстоянии у прокариот встречается реже, чем у эукариот, но не является необычным.
Например, фосфорилированная форма белка пггС может стимулировать транскрипцию, даже если сайты связывания этого белка удалены от промотора на расстояние более 1000 п. н. Д. Неправильно. Сигма-факторы взаимодействуют со специфической последовательностью ДНК, но лишь тогда, когда они входят в состав РНК-полимеразы. Аналогичным образом белки-активаторы взаимодействуют с РНК-полимеразой, но лишь в том случае, когда они связаны со своими специфическими сайтами узнавания в ДНК. Е. Правильно. Ж.
Правильно. 3. Неправильно. Лишь немногие энхансеры активны почти во всех типах клеток. Большинство из них хорошо работает лишь в некоторых типах клеток. И. Правильно. К. Неправильно. Кроме связывания с низкомолекулярными веществами у эукариот есть и другие механизмы активации регуляторных белков, включая синтез белка, фосфорилированне и эффект регуляторных субьединиц. Л. Правильно. 10-8 А. Быстрый рост бактерий в начале эксперимента происходит в результате метаболизма глюкозы, а замедленный рост в конце- вследствие метаболизма лактозы.
Бактерии переставали расти в середине эксперимента, поскольку они уже исчерпали всю глюкозу, но у них еще не было ферментов, необходимых для метаболизма лактозы. Перед тем как они смогут использовать лактозу, содержащуюся в среде, в них должна произойти индукция 1ас-оперона. Задержка роста приходится как раз на то время, когда происходит индукция. Б. Для индукции лактозного оперона необходимы два условия: в среде должна содержаться лактоза, а глюкозы быть не должно, В первой части эксперимента в среде присутствуют и глюкоза, и лактоза, следовательно„это требование не выполняется.
Лишь когда вся глюкоза оказывается израсходованной, создаются условия, необходимые для индукции. Контроль генной экспрессии 411 полимеразе Уетса Сдр-сДМР, ы начать синтез РЙК длн сензыеания с ДИК требуетс присутствие од Репрессор далман отсоединиться, ~тобы могла начаться полимеризанин Репрессор Рве. 10-29. Ипдукпия Гас-опсропа (огвет 10-8). Белки и ДНК изобра- кспы примерно в одном мас- штабе. Трехмерная структура САР известна, а структуры РНК-поли- мсразы и репрсссора еще не опре- делены. В индукции участвуют САР и репрессор лактозного оперона Грие. 10-29).
Для включения оперона САР должен связаться с ним, а репрессор лактозного оперона должен отделиться. Присутствие лактозы в среде способствует повышению внутриклеточной концентрации аллолактозы, которая связывается с лактозным репрессором, вследствие чего происходит снижение ехо сродства к соответствующему сайту связывания н в результате--отсоединение от ДНК. С удалением лактозного репрессора удовлетворяется одно условие индукции. Второе условие связано с концентрацией глюкозы. Прн снижении концентрации глюкозы внутриклеточный уровень сАМР повышается; сАМР связывается с САР и изменяет его конформацию таким образом, что тот становится способным взаимодействовать со своим сайтом связывания.
Когда САР присоединен (а репрессор лактозного оперона отсутствует), РНК- полимераза может связаться с промотором н начать транскрипцию. Литература: молот!, А ТЬс рЬелотпспоп оГ епхугпвбс ас)ар!а!!оп, Стготу!Ь Бугпрояшп Х1: 223- 289, 1947. !Ксрг1п!есГ Гп Бс!ссустГ Рарегз ш Мо!ссп!аг ВГо!ояу Ьу )асс!вез Молот) (А.
Г.туоГГ, А. 17!1птапп, стгз), рр. 68-134. ЬГету Уог)с АсвсГсппс Ргсзк 1947.) ром гена глутаминсинтетазы, однако она не способна индуцировать транскрипцию, поскольку находится в закрытом комплексе. Взаимодействие с фосфорнлнрованным белком и!гС дает возможность РНК-полимеразе образовать открытый комплекс и таким образом начать транскрипцию.
Б. Белок и!гС может связываться со своими сайтами связывания независимо от того, фосфорилирован он илн нет, однако актнвировать РНК-полимеразу он не может, пока не будет фосфорилирован. Лишь фосфорилированный белок и!гС способен связаться с РНК-полнмеразой и стимулировать образрвание открытого комплекса, способствуя таким образом началу транскрипции, В. Транскрипция может стимулироваться фосфорилированным белком п1ГС и в отсутствие связывающих его сайтов, но лля этого необходимы высокие концентрации белка пггС.
Сайты связывания с белком и!гС служат для повышения его концентрацуш вблизи промотора гена глутаминсинтетазы, В отсутствие сайтов связывания и!гС необходимая высокая концентрация этого белка может послужить причиной ненужной активации РНК-полимераз, связанных с другими промоторами. Наличие сайтов связывания и!гС обеспечивает активацию гена глутаминсинтетазы при таких относительно низких концентрациях белка и!гС, когда промоторы, не имеющие сайтов связывания пггС, не активируются. 10-9 А. РНК-полимераза в отсутствие и!гС может связываться с промото- 412 Глава 10 Литература: Гг'Ггда, А, ус дедгег, Г., А МадаеалгГг, В.
1шг!айоп о1 ггапзспрбоп а! бзс Ьасгепа1 дМАр2 ргопюгег Ьу рпг!Ггес$ Е, год сопгропепм зя Гас!1!га1ег! Ьу епйапсегв. Се1! 50, 1039-.1046, 1987. петля днк агас 10-10 ягяо Рис. 10-30. Схема, показывающая результат введения полувитка в петлю ДНК, образованную в результате взаимодействия двух белков (ответ 10-10). Литература: пипа, Т. Мс НаЬп, Яс Одеев, Яе деЫеГ.
й. К Ап о рога!от аг — 280 Ьазе ра!гз !Ьаг и гечп!ген Гог гергемюп оГ агаВАГ1 орегон ргогпогег: агЫ!1!оп оГ ГуЫА Ье!!са1 пзгпа Ьепдееп 1Ье орегагог апг! ргогпогег сус!гса!1у )йпдегз гергемюп. Ргос. Ыаг1. Асад. Бсь ГГБА 81, 5017-5020, 1984. 10-11 Способность фактора транскрипции стимулировать транскрипцию в ядерных экстрактах, начиная с делеции — 61, но не с делеции — 50, указывает на то, что критически важная часть сайта связывания фактора лежит в интервале между нуклеотидами — 61 и — 50, расположенными перед точкой начала транскрипции.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
