Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 119
Текст из файла (страница 119)
Следовательно, продукт гена Р2 может быть репрессором М-специфических генов. И наконец, хотя мутации М2 и Р1, по-видимому, не оказывают воздействия на гаплоидные клетки, в диплоидных клетках каждая из этих мутаций препятствует экспрессии генов, специфических для споруляцин. Это говорит о том, что они могут действовать совместно, активируя гены, специфические для споруляции. Эти три подсказки помогают выявить три типа регуляторных взаимодейсзвий и, таким образом, согласовать между собой все полученные результаты. Для того чтобы считать схему, приведенную ва рнс. 10-32, целиком доказанной, необходимы дополнительные генетические и биохимические эксперименты.
!0-19 А. Интенсивности полос РНК макси-гена и нормальной 55-РНК при электрофорезе смеси матриц, не обработанных рестриктазамя (дорожки, обозначенные «Без обработки» на рис. 10-11, Б), одинаковы, следовательно, уровень метилирования гена 5Я-РНК не влияет на его транскрипционную ахтивность. Б. Результаты транскрипции после обработки матриц рестрикта- зами такие, как вы и ожидали. Транскрипция с целиком метилированного макси-гена 55-РНК специфически подавляется после обработки рестриктазой !Урп1, которая расщепляет лишь полностью метилированные сайты рестрикции.
Обработка МЬо! специфически подавляет транскрипцию неметилированных генов 5Я-РНК, а обработка рестриктазой ЯапЗА, которая нечувствительна к уровню метилирования сайта рестрикции, вызывает подавление транскрипции всех генов 5Я-РНК. В. Характер транскрипции после репликации и расщепления свидетельствует о том„что транскрипционные комплексы в ходе репликацни не остаются связанными с макси-геном 55-РНК. Если бы реплицированные молекулы оставались в активном транскрипционном комплексе, то транскрипционная активносп, должна была бы выявиться после обработки рестриктазой 1урп), которая не расщепляет реплицированные молекулы. Активность, остающаяся после обработки МЬо1, определяется полностью метнлированными молекулами ДНК, которые не реплицировались. Если бы транскрипционные комплексы не удалялись при репликации, то активность сохранялась бы и после обработки 1)рп1.
Г. Если бы всего 50% молекул образовывали активные транскрип- ционные комплексы, то распределение полос не должно было бы измениться (уменьшилась бы только нх интенсивность). Однако в этом случае вы не смогли бы сделать вывода о том, что пря репликации происходит удаление транскрипционных комплексов, Если бы только 50% молекул образовывали комплексы и только 50% молекул реплицировались, то скептик (каким и должен быть настоящий ученый) мог бы предположить, что сборка транскрипционного комплекса подавляет репликацню и реплицируются только те молекулы, которые не образуют комплексов. Таким образом, в подобном эксперименте невозможно было бы проверить то, что задумано.
Суть возражений станет понятнее, если вы представите, что 10% молекул образовали транскрипционные комплексы и 10% реплицировались. Для того, чтобы ваши выводы оказались правомочными, важно доказать, что молекулы, несущие транскрипцнонные комплексы, реплицирова- Контроль генной экспрессии 470 лись. Хотя можно попытаться каким-либо образом специфически определить репликацню в транскрипционных комплексах, однако самый простой способ-это показать, что фракция реплицирующихся молекул значительно больше, чем фракция молекул, не входящих в транскрипционные комплексы. Литература: И~о10е, А.Рс Вгоип, 1З.п. Р1ЧА гер11сабоп 1п лгго егаэез а Хепориэ 5Я йучА аепе ггапэспрооп согпр1ех.
Сей 47, 217 — 227, !936. 10-20 А. Сохранение метилированных последовательностей ССг зависит от поддерживающей метилазы, которая обычно присутствует в клетках млекопитающих. Эта метилаза превращает наполовину метилированную ДНК (в которой СО метилированы лишь в одной цепи) в полностью метилированную ДНК (метилированную по комплементарным СО в другой цепи). Такое превращение должно осуществляться после каждого цикла репликации, чтобы поддерживался уровень метилирования ДНК. Конструкции, введенные в клетки, напоминали нормальную, наполовину метилированную ДНК, возникающую при репликации. В соответствии с этим поддерживающая метилаза превращала наполовину метилированные сайты ССг в полностью метилированные и затем поддерживала их в метилированном состоянии.
Метилированные цитозиновые нуклеотиды, не входящие в состав последовательностей ССг, не являются субстратом для поддерживающей метилазы. Следовательно, при каждом цикле репликации их число снижалось вдвое; таким образом, когда клетки собирали для анализа, концентрация метилированных цнтозиновых нуклеотидов, не входящих в состав последовательностей ССг, была уже так низка, что они не могли быть обнаружены. Б. Рестрикционные фрагменты, образующиеся при обработке Н)пЖ11 и чувствительными к метилированию рестриктазами Сро! и Нра11, получаются именно такими, какие можно было ожидать, исходя нз расположения метильных групп во введенных конструкциях.
Поскольку рестрикты размерами менее 1 т.п.н. не определяли, то фактически в этих экспериментах анализировали только четыре чувствительных к метилированию сайта рестрикции: оба сайта Нрай и два сайта С1о1, окружающие центральный сайт Нра1!. Если во введенной конструкции один из этих сайгон не был метилирован, то он оказывался чувствительным к разрезанию в составе клеточной ДНК.
Если во введенной конструкции один из этих сайтов был метилирован, то он не был чувствителен к разрезанию в составе клеточной ДНК. Весьма важно не упускать из вида, что в нормальном гене у-глобина имеется 27 последовательностей ССг. В приведенных экспериментах лишь четыре из них были проанализированы путем обработки чувствительными к метилированию рестриктазами. Поскольку большинство последовательностей ССг не являются частью сайтов узнавания для чувствительных к метилированию рестриктаз, то для того, чтобы определить, сохраняются ли эти последовательности, необходимо провести иные эксперименты.
В. Эти результаты убедительно показывают, что один ключевой сайт метилирования не может быть ответственным за то, будет ген экспрессирован или нет. Если бы такой единственный сайт существовал, то разница между транскрипционной активностью конструкций В (О'Ь) и С (100ьгь) свидетельствовала бы о том, что 420 Глава 10 сайт расположен в области, которая не метилирована в конструкции С и метилирована в конструкции В, т. е.
в одной из пяти последовательностей СО (с 12-й по 1б-ю), представленных в увеличенном на рис. 10-12,Б участке вокруг точки начала транскрипции. Однако ни конструкция 13, ни конструкция Е не образуют транскрипта у-глобина. Посколъку в конструкции 13 не метилированы сайты 14, 15 и 16, а в конструкции Е не метилированы сайты 12 и 13, то один неметилированный сайт не может быть единственным фактором, определяющим экспрессию гена у-глобнна. Авторы этих экспериментов склоняются к мысли, что для достижения максимальной экспрессии гена достаточно большой участок (больше того, который есть в конструкции Г) вокруг промотора не должен содержать сайты метилирования. Литература: Мвггау, Е.3„6готе!й Г.
81Се-врес~йс сСепсеССсу1аСсоп пп ССсе ргопюсег оГ Ьппсвп у-8!онп сСоев пос а11емасе псесьу!абоп пседсасей шрргевйоп. ЕМВО У. 6, 2329 — 2335, !987, Посттранскрннннонный контроль 10-21 А. аттенуация транскрипции Б. альтернативный сплайсинг РНК В. изоформы белка Г. ген Д.
негативный; трансляция Е. позитивный; трансляция Ж.сдвиг рамки трансляции 3. редактирование РНК 10-22 А. Неправильно. У прокариот в аттенуации транскрипции участвуют связанные рибосомы. Ъ' зукариот же в ядре нет функциональных рибосом. Следователъно, у эукариот в аттенуапии транскрипции, вероятнее всего, участвуют регуляторные молекулы, которые связываются со специфической последовательностью РНК. Б. Правнлъно. В.
Правильно. Г. Неправильно. При сплайсинге РНК могут образоваться такие мРНК, в которых последовательность, кодирующая карбоксильный конец исходного белка, полностью отсутствует и замещена другой последовательностью. Д. Правильно. Е. Неправильно. Железо связывается с белком-регулятором, а ие с чувствительным к железу элементом в мРНК ферритина, В отсутствие железа белок-регулятор связывается с этим элементом в мРНК, что препятствует ее трансляции. В присутствии железа белок-регулятор связывается с ним, отделяясь от молекулы мРНК ферритина, которая после этого транслируется. Подобный механизм позволяет в ответ на увеличение содержания железа синтезировать больше молекул ферритина.
Ж. Правильно. 3. Правильно. И. Неправильно. Стабильность мРНК трансферринового рецептора и способность мРНК ферритнна транслироваться рехулируютса одним и тем же РНК-связывающим белком, чувствительным Контроль генной экспрессии 423 К. Правильно. Л. Правильно. 10-23 А. Поскольку мРНК кальцитонина образуется в том случае, когда Б В Г к железу, однако результаты этого связывания для двух мРНК оказываются различными. Связывание с чувствительным к железу элементом, локализованным у 5'-конца мРНК ферритина, приводит к остановке трансляции и снижению уровня ферритина. С другой стороны, при связывании с чувствительным к железу элементом, расположенным на 3'-конце мРНК трансферринового рецептора, мРНК стабилизируется, в результате чего может образоваться болъше молекул трансферринового рецептора.
клетки трансфицированы геном дикого типа, а мРНК СОВР синтезируется, когда они трансфицированы геном, содержащим мутацию по сайту сплайсинга экзона 4, то в лимфоцитах должны содержаться все факторы процессинга, необходимые для получения мРНК обоих типов.
Если экспрессия мРНК кальцитонииа в линии клеток лимфоцитов зависит от отбора сайта полиаденилирования, то мутант, у которого отсутствует такой сайт в экзоне 4, должен был образовывать мРНК СОВР. Действительно, если сплайсивгу экзона 3 с экзоном 5 (он необходим для образования мРНК СОКР) препятствует использование сайта полиаденилирования в экзоне 4, то при удалении этого сайта должна образовываться мРНК СОВР. Напротив, мутантный ген, в котором отсутствует сайт сплайсинга экзона 4, подвергался бы полиаденилированию преимущественно в экзоне 4, что должно препятствовать образованию мРНК СОКР. (Как будет объяснено в пункте Г„хотя мРНК СОКР и не образуется на гене, мутантном по сайту сплайсинга экзона 4, однако структура продуцируемой в этом случае аберрантной мРНК не соответствует такому простому механизму.) Если экспрессия мРНК кальцитонина в линии клеток лимфоцитов зависит от отбора сайтов сплайсинга в экзоне 4, то следует ожидать, что мутант, у которого существует этот сайт, будет образовывать мРНК СОВР.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
