Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 112
Текст из файла (страница 112)
На стадии Оз в точках начала репликацни действует блокада повторного синтеза ДНК, возникающая во время Б-фазы. 9-18 А. Области треков с большим количеством гранул серебра соответствуют тем фрагментам ДНК, которые реплшшровались при высокой концентрации метки. Области с меньшим содержанием гранул соответствуют тем участкам ДНК, которые реплицнровались при сниженной концентрации метки.
Б. Различие в расположении темных и светлых участков на треках возникает вследствие того, что в двух экспериментах мечение осуществлялось по-разному. В первом опыте (рнс. 9-14, А) зН-тимнднн вводили сразу же после прекращения блокады синтеза ДНК, применяемой для синхронизации. Следовательно, репликация в точках ее инициации начиналась в присутствии метки, что приводило к возникновению темных участков по обеим сторонам от точки начала реплнкацин. При снижении когщентрацни метки реплнкацня распространялась в обоих направлениях от точки начала реплнкацнн, образуя светлые участки на каждом конце темных учасп:ов. Во втором опыте (рис.
9-14, Б) репликация в точках ее инициации начиналась в отсутствие зН-тимидина, и, таким образом, точка начала репликации оставалась немечсной. Внесение большого количества метки и последующее снижение ее концентрации приводили к возникновению темного участка со светлым фрагментом на одном конце. Соседние темные области Клеточное ядро Зяб определить, исходя из времени мечения и длины пометившихся областей.
В первом эксперименте участки длиной около !00 мкм метились за 45 мин. Поскольку в синтезе каждого меченого сегмента участвуют две репликативные вилки, то каждая из них за 45 мин синтезирует примерно 50 мкм ДНК. Таким образом, скорость движения репликативной вилки равна приблизительно 1,1 мкм/мин (50: 45 = 1,1). Во втором опьзте за это время помстились фрагменты размером около 50 мкм, однако каждый из этих участков был синтезирован лишь одной рспликативной вилкой.
Таким образом, скорость продвижения репликативной вилки здесь также равна примерно 1,1 мкм!мин (50: 45 = 1,1). Этих данных недостаточно, чтобы определить время, необходимое для репликацни всего генома. Не хватает сведений о числе активных точек начала репликации и их распределении. Лвтература: БиЬеппал, д Ас д!яда А.гз. Оп 1Ье тесьап!зщ о! ПЫА гер!1сайоп 1и танцов!вал сЬгопюзощс.
3. Мо!. Вю!. 32, 327- 341, !968. 9-19 А. В области фрагмента длиной 4,5 т. и. н. гибридизация происходит с теми плазмидами, которые ко времени выделения ДНК ешс нс реплицировались. На то, что болыпинство плазмидных молекул еше не реплицировалось, указывает интенсивность этого пятна. Низкая частота реплицируюшихся плазмидных молекул даже в Я-фазе — это один из факторов, которые затрудняют доказательство того, что АВВ представляет собой точку начала репликации.
Б. Результаты, приведенные на рис. 9-16, показывают, что Ацо! служит точкой начала репликации. Распределение полос в геле при разделении ДНК, обработанной нуклеазой Вя!11, выглядит так, как если бы реплицируюшисся молекулы имели два разветвления (рис. 9-15,Б), Результаты, полученные для ДНК, обработанной Реп), выглядят как зоны, образованные промежуточной репликативной формой, у которой репликационные глазки расположены асимметрично (рис. 9-!5,Г).
(Очень короткий пхвоств в пятне, соответствующем молекулам длиной 9 т.п.н. на рис. 9-16,Б, указывает на то, что репликационные глазки в реплицируюшихся молекулах расположены немного асимметрично.) Именно такие зоны в геле ожидаются в случае, если репликация начинается с АКВ1. Как показано на рис. 9-39, расщепление ферментом ВяП1, который разрезает последовательность в сайте АК81, приводит к образованию молекул с двумя разветвлениями. Обработка Руп1, которая разрезает кольцевую молекулу примерно против сайта Агап!, приводит к образованию молекул с несколько асимметрично расположенными репликационными глазками. Разрыв в дугообразной зоне, содержащей продукты гибридизации с плазмидами, обработанными Руп! (рис.
9-16,Б), возникает вследствие того, что формы с разветвлением и формы с репликационным глазком различаются по подвижности. Молекулы, только что начавшие реплицироваться, при расщеплении Реп! образуют формы с глазком, а молекулы, в которых реплнкация уже прошла сайт Руп1, превращаются в форму с разветвлением. Таким образом, реплицировавшаяся молекула, разрезанная рсстриктазой, несет либо глазок, либо разветвление, и никаких других промежу- Рно! анн! а! взщ Обаабонка ВВП! Обработка Рно ! В Рве. 9-39.
Превращеипе рсплвци- ууюпзвхсв плазмпдных молекул в апвейвыс формы с двумя раз- мгвленяамп при обработке Вйй1 ббв в линейные формы с несколько асимметрично расположенными рапввкациоппымп глазками прп обработке Рнп! (ответ 9-19). фактически являются частями одной и той же реплицируюшейся молекулы ДНК. Между ними лежат немеченые (а потому невидимые) сегменты, содержащие точки начала репликации. В. Скорость движения репликативной вилки можно приблизительно 396 Глава 9 точных форм нет. Поскольку две формы различаются по подвижности, на электрофоретической картине виден разрыв. Лщературщ Вгеиег, В.У.; Галдтал, И',ь.
ТЬе 1оса1аа11ол оГ гер1кабоп опрла оп Айб р!аагл1<Ь (л о. оггеоигае. Со!1 51, 4бЗ "471, 1987. А. Кроме способности специфически связываться с определенным участком ДНК Т-антиген обладает еще АТР-зависимой геликазной активностью. Геликазная активность необходима для расплетааия ДНК (см. МБК, гл, 5). Наличие Т-антигена в репликативнык вилках также подтверждает то, что он обладает геликазной активностью. Способность Т-антигена специфически связываться с точками начала репликации вируса БЧ40 н расплетать в них цепи ДНК реализуется на первой стадии репликации ДНК. Подобная активность приводит к экспонированию одноцепочечных областей, н праймазы и ДНК-полимеразы получают доступ к ДНК.
При этом Т-антиген, вероятно, управляет связыванием одного иля нескольких таких компонентов: антитела к Т-антигену осаждают комплекс ДНК-полимераза — праймаза, а Т-антиген способен стимулировать репликацию точек начала репликации БЧ40 лишь в определенных типах клеток.
Все это дает возможность заключить, что инициация зависит от специфического взаимодействия Т-антигена с одним или несколькими компонентами механизма репликации, действующего в клетке. А. РАСПЛЕТАНИЕ НАЧИНАЕТСЯ не в точке ЯАчллА РЕПЛИКАЦИИ Точка начала раллнкации ! Б. Для демонстрации того, что участки неспаренных оснований рас положены в точке начала репликации, можно обработать ДНК рестрнктазой, которая разрезает молекулу в строго определенном месте относительно точки начала репликацни. (С помощью электронной микроскопии невозможно различить два конца линейной молекулы, поэтому, чтобы точно определить положение расплетенных областей, требуется обработка по крайней мере двумя разными рестриктазами.) Если в точке начала репликацни расплетания не происходит, то расплетенные участки не захватят этот сайт (рис.
9-40,А). Если расплетание происходит в точке начала репликации, то расплетенный участок будет включать эту область. В случае когда расплетание распространяется в одном направлении, точка начала репликации совпадает с одним концом области расплетания (рис. 9-40, Б).
Когда расплетание происходит в обоих направлениях (с одинаковой скоростью), центр расплещнной области совпадает с точкой начала репликации (рис. 9-40,В). Результаты данного эксперимента указывают на то, что расплетание происходит по обоим направлениям и примерно с одинаковой скоростью. Б. РАСПЛЕТАНИЕ В ОДНОМ НАПРАВЛЕНИИ Точка начала ралликации Б. РАСПЛЕТАНИЕ 8 ОЕЕ СТОРОНЫ Точка начала ралликации В. Для расплетания замкнутых колыгевых молекул ДНК необходима топоизомераза Е которая устраняет избыточные витки цепи в дуплексной части молекулы.
В ковалентно замкнутом кольце устранение закручивания дуплекса на одном участке приведет к тому, что остальная часть молекулы приобретает дополнительные витки, а это энергетически невыгодно. Кратковременное воздействие топоизомеразы 1, образующей разрывы и зашиваюшей их, позволяет снять это напряжение закручивания.
Рис. 9-40. Использование рестрнк- таз для локализации сайта рас- плетаяия Т-антигоном относитель- но точки начала рецлякацян вируса ВЧ40 (ответ 9к20). Концы линейной молекулы образовались в результа- те расщепления рестряктазой. точки начала репликации БЧ40, встроенной в хромосому, то образовалась бы сложная многоцепочечная структура. Три цикла инициации в точке начала репликации показаны на рис. 9-41. Очевидно, встроенная в хромосому точка начала репликация Г, Если бы Т-антиген многократно инициировал репликацию с Клеточное ядро 397 Рис. 9-41.
Многократная иннцаа- щп в точке начала реппикацпи таруса БЧ40, встроенного я хромо- мму (ответ 9-20). Лераий атарлй цин цикл нцциа. инициации ) Третий цик инициаци дл инициации Точка начала релликации ции ВЧ40 в присутствии Т-антигена реплицируется так, как показано на рис. 9-41. Этот процесс называется репликацней «по типу капусты», поскольку в результате получается слоистая структура, напоминающая кочан капусты. Лятерйтурат РоеГтои, Мс Реаи, В.В.; Ви11ооц Р„бсьо1а, Ос Оитне11к Х 1)пклпгйпя оГ дпр1ех ОучА Гтогп 1Ье ЯЧ40 от181п оГ гер!есабоп Ьу Т-апйяеп.
Яс1епсе 238, 964-967, 1987. 9-21 А. ДНК из амплифицнрованного кластера представляет собой структуру типа капустного кочана, похожую на ту, что изображена на рис. 9-41. С помощью электронного микроскопа в ДНК фоллнкулярных клеток, находящихся на поздней стадии развития, обнаружены многочисленные скопления репликативных вилок, что соответствует модели амнлификации по типу кочана капусты.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
