Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 104
Текст из файла (страница 104)
Поскольку сигнальный пептид для импорта белка в митохондрию расположен на его Ь)-конце, то некоторые из частично синтезированных митохондриальных белков, все еше прикрепленные к рибосомам, могут в этих условиях взаимодействовать с митохондриальной мембраной.
В результате начавшийся импорт даже одного такого белка приводит к прикреплению рибосомы и связанной с ней мРНК (а также других рибосом, транслирующих ту же молекулу мРНК) к митохондриальной мембране. Литература! Кейеп!д л.Е., А)дхпп, КГ., Витои, Я.А. Сугор)азгп)с !уре 80$ пЬояннез аыос)а!ей ийЬ уеаз! гп!4осьопдпа.
!Ч. Апасвгпел! о! пЬояпнет 7о Гпе оьчет и!е!лЬгапе ог йо)а!ей пн!осЬоп!)па. 1. Сей 8!о!. 65, ! — 14, ! 975. 8-17 Как показано на рис. 8-21, пептиды ! и 2 способны к образованию амфипатических спиралей с гидрофобными аминокислотами на одной стороне и гидрофильными-на другой стороне спирали, Однако пептид 1 несет несколько отрицательно заряженных аминокислот на своей гидрофильной стороне и поэтому вряд ли может служить сигнальным пептидом для импорта в митоховдрию. Только пептид 2 имеет положительно заряженную гидрофильную сторону спирали, поэтому именно он, вероятно, служит Внутриклвточная сортировка мвкромолвкул 369 сигнальным пептидом для импорта митохондриальных белков.
Пептид 3 несет положительный заряд, но не может служить сигналом для митохондриального импорта, так как гидрофильные и гидрофобные аминокислоты расположены в нем вперемежку. 8-18 А. Импорт всех четырех белков в хлоропласты в вашем опыте происходил очень эффективно, о чем свидетельствует малая величина фракции предшественника (рис. 8-8, Б, верхняя полоса, дорожка 2), которая остается после инкубацин с хлоропластами. Эта неболыпая фракция предшественника находится вне хлоропластов во всех случаях, поскольку она подвергается воздействию протеазы (рис. 8-8,Б, дорожка 3). Б. В вашем опыте ферредоксин локализован в своем обычном компартменте судя по избытку его во фракции стромы (рис.
8-8, Б, ФДФД, дорожка 5) и отсутствию в других фракциях. Пластоцианнн также локализован в своем обычном компартменте — просвете тилаконда, поскольку большая часть его связана с тилакоидами (рис. 8-8, Б, ПЦПЦ„дорожка 6, нижняя полоса) таким образом, что он не может расщепляться добавленной протеазой (рис. 8-8, Б, ПЦПЦ, дорожка 7). В. Гибридные белки импортируются в те компартменты хлороплас- та, которым соответствуют их 1ч-концевые последовательности. Этот результат наиболее очевиден для ФДПЦ, который локализован исключительно во фракции стромы (рис. 8-8,Б, ФДПЦ, дорожка 5), как и ферредоксин. В отличие от этого лишь небольшая доля ПЦФД входит в просвет тилакоида (рис, 8-8,Б, ПЦФД, дорожка 6, нижняя полоса). По-видимому, некоторое количество этого белка связывается с мембраной тилакоидов, поскольку он расщепляется при обработке протеазой (рис.
8-8, Б, сравните верхние полосы дорожек 6 и 7); однако большая часть его обнаруживается во фракции стромы (рис. 8-8, Б, дорожка 5). Имеется ряд причин„по которым импорт ПЦФД в просвет тилакоида может быть неэффективным. 1) Может быть затруднено проникновение домена ферредоксина через тилакоидную мембрану. Он, однако, проходит через наружную и внутреннюю мембраны, а его общий заряд практически равен заряду пластоцианина, который преодолевает тилакоидную мембрану.
2) Железосерный центр обычно включается в ферредоксин на определенном э~вне созревания молекулы. Таким образом, возможно, что этот центр присоединяется в стреме и по этой причине ферредоксин не может пересечь мембрану тилакоида. 3) Ферредоксин обычно функционирует в строме в комплексе с другими белками. Возможно, что домен ферредоксина в ПЦФД связывается с этими белками и остается таким образом в строме. Эти соображения часто усложняют интерпретацию экспериментов такого рода, направленных иа выявление сигнальных участков для импорта белков. Г.
Множественные полосы в ваших опытах — это ключ к пониманию импорта белков в хлоропласты. Самая верхняя полоса для всех белков -это предшественник, т.е. первичный продукт трансляции, поскольку он присутствуе~ в реакционной смеси при трансляции 1п уйго в отсутствие хлоропластов (рис. 8-8, Б, дорожка 1). Полосы, расположенные ниже, содержат белки, от которых отделилась часть молекулы.
Вы ожидали, что пептид должен отщепляться с )т(-конца (это то, из-за чего задумывался весь эксперимент), и результаты действительно подтверждают, что сигнальные пептиды локализованы на )М-конце. Две полосы при электрофорезе и-!42т 370 Глава 8 Наружная мембрана Межмембранное пространства ФД ф Внутренняя мембрана Строма Типакоидная мембрана Просвет типакоида Рве. 8-22. Схема, иллюстрирующая роль сигнальных пептидов в на- правлении транспорта фсрредокся- иа и пластопиаввиа к соответ- ствующим яомпартмсвтам в хпоро- пласте (отвст 8-18).
ПЦ обнаруживаются в том случае, когда Н-концевой сегмент происходил из ферредоксина (рнс. 8-8, аа, ФДФД и ФДПЦ, дорожка 2), а картина с тремя полосами наблюдается в том варианте опыта, где Х-концевой сегмент происходил из пластоцианина (рис. 8-8, Б, ПЦПЦ и ПЦФД, дорожка 2). Наличие только двух полос в случае белков, несущих сигнальный пептид для ферредоксипа, указывает на то, что импорт ферредоксина в строму сопровождается одним актом отщепления. Нижняя полоса соответствует функциональной форме ферредоксина в строме (ср. ФДФД, ФДПЦ, дорожки 2 и 5).
Образование трех полос в случае белка с сигнальным пептидом для пластоцианина свидетельствует о том, что при импорте этого белка в просвет тилакоида происходят два последовательных расщепления пептилной связи. Самая нижняя полоса соответствует функциональной форме пластоциаиина в тилакоиде (ср. ПЦПЦ, ПДФД, дорожки 2 и 7). Промежуточная полоса относится, вероятно, к промежуточной стадии импорта н указывает на то, что сигнальный пептид содержит два компонента, которые отщепляются последовательно. Х-концевой компонент сигнального пептида направляет белок в строму, а С-концевой компонент того же пептида-в просвет тилакоида.
Д. Модель, суммирующая роль сигнальных пептидов в импорте ферредоксина и пластоцианнна в соответствующие компартменты хлоропластов, изображена на рис. 8-22. Для каждого белка сигнальный пептид показан как прямоугольник на Х-конце белка. Зачерненная часть прямоугольника соответствует той части сигнального пептида, которая необходима для импорта через наружную и внутреннюю мембраны хлоропласта.
Этот сигнальный пептид отделяется, когда белок пересекает мембрану и входит в строму. Незачерненная часть прямоугольника, связанная с пласгоцианином, нужна для импорта через тилакондную мембрану. Она удаляется при импорте в полость тилакоида. Литература: дтееГтепа, Я., Ваиегуе, С., Оадетап, й., Кеедажа, К., Уепьее1с, Р. Туес го1с оГ г)тс Ггала1 рер1)йе 1л 1)тс тоабля оГ ргссагаота готуагд дйустсп1 сЫогор!ааГ союРапщел1. Сс!1 46, 365 .375, 1986. Внутрнклеточнаи сортировка макромолекул 371 Перо ксисомы 8-19 А. пероксисомы Б, глиоксилатный цикл; глиокснсомы 8-20 А. Неправильно. За редким исключением, как, например, в случае эритроцитов, все клетки млекопитающих имеют в своем составе пероксисомы, а для немногих типов клеток характерны крупные пероксисомы.
Б. Правильно. В. Неправильно. Новые пероксисомы возникают из ранее существовавших в результате роста и деления органелл. Все мембранные белки и липнды пероксисом поступают из цитозоля. 8-21 А. Результаты опытов по гибридизации, представленные на рис. 8-9, показывают, что мРНК генов 1 и 3 для ФГК экспрессируются у трипаносом из человека, а мРНК генов 1 и 2 для ФГК -у трипаносом из мухи цеце. Б. Гликосомная форма ФГК экспрессируется только в трипаносомах, выделенных из организма человека. Поскольку олигонуклеотидный зонд к гену 3 для ФГК гибридизуется с мРНК, которая экспрессируется только в трипаносомах из человека, можно сделать вывод, что ген 3 для ФГК, по-видимому, кодирует гликосомную форму ФГК.
В. Результаты, представленные на рис. 8-9, указывают на то, что неточность сортировки не является причиной слабой активности цитозольной ФГК в трнпаносомах из человека. Ген 1 для ФГК экспрессируется на низком уровне как в трипаносомах из человека, так и в трипаносомах из мухи цеце, Поскольку вся активность ФГК у трипаносом из мухи цеце обнаруживается в цитозоле, то ген ! для ФГК должен кодировать цитозольную форму ФГК. Ген 1 для ФГК экспрессируется в трипаносомах из человека, поэтому он, вероятно, ответствен за слабую активность ФГК в цитозоле трипаносом из человека. Таким образом, нег данных в пользу того, что импорт в гликосомы в трипаносомах из человека является неточным.
Литература: Обида, К. А., Вити!ге!в, В. Иг., Олггоа, !г'. С., Вогвг, Р., Ггеепетан, О.Н., Гак Вост,.Г,Н., МыягГг, Р,А.М., ОррегАоев, КЯ. Торояспев1в сГ ппсгоЬсгГу елкуглев: всчиепсе сспграг!вол сГ ГЬе Кепев Гог !Ье К!уссвспа! !иг!сгсЬссу) апд су!свс1гс рЬоврЬоя!усегаве !аиавев сГ Туураномта Ьгисег ЕМВО 1.
4, 3811- 38!7, !985. 8-22 В результате слияния клеток от больных с синдромом Целлвегера, имеющих дефекты в разных генах, в гибридной клетке были бы представлены все белки, обычно связанные с перокснсомами. Если пероксисомы возникают из эндоплазматического ретикулума, они должны образовываться в слившихся клетках, поскольку все необходимые белки в последних представлены. Если, однако, пероксисомы возникают только из уже существующих пероксисом, то в гибридных клетках пероксисомы не будут образовываться, так как ни в одной из родительских клеток пероксисомы ие содержатся.
Заметьте, что эксперимент позволяет сделать выбор между этими двумя гипотезами только в том случае, если сливающиеся 372 Глава 8 клетки дефектны по разным генам. Если клетки имеют дефект в одном и том же гене, то после слияния пероксисомы не должны образовываться, независимо от того, какая из гипотез верна, если вообще какая-нибудь из них справедлива. Литература: Вогж, Р. Нов рго1е!пз яе1 ппо тьзгоЬообез (регох!зовеь 81уохухолзез, 8!усозошез). ВюсЬлп. ВюрЬух.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
