Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 103
Текст из файла (страница 103)
После количественного определения белка ОДКазы оказалось, что уровень белка и ферментативная активность снижались параллельно друг другу с одинаковымн скоростями. Эти данные указывают на то, что в нормальных клетках фермент очень нестабилен. В. Поскольку периоды полужизни других белков в клетках мутантной линии остались прежними, то изменение этого параметра должно быть специфично именно для ОДКазы. Стабильность белка, по-видимому, зависит от вида Гч(-концевого аминокислотного остатка. Следовательно, изменение периода полужизни ОДКазы могло произойти из-за того, что в сформированном ЬГ-конце терминальной стала другая аминокислота. (Такое изменение могло и не обнаружиться при исследовании структуры и ферментативных свойств ОДКазы, которое вы провели предварительно.) С другой стороны, возможно существует некая специальная «маркирующаяв система, которая в норме метит молекулы ОДКазы для их деструкции.
В этом случае линия мутантных клеток могла, по-видимому, утратить некоторые компоненты этой «маркирующей» системы. Лвтератураг РгггсГгап1, М.Г., Редд, А. Е., ЗеЯегаол, Г..5. От11ЬГле г(есагьоху!аае Ггот Ьераголга се1!а алгГ а чаг1алг се11 1Гле гл гчЬГсЬ ГЬе елауте га тоге агаЫе. 5. 81о1.
СЬегл. 257, 5892-5899, 1982. Транспорт молекул белков и РНК в ядро и из ядра 8-9 А. ядерная оболочка Б, внутренняя ядерная; наружная (внешняя) ядерная В. ядерные поры; поровый комплекс ядерной оболочки Г, импорт в ядро 8-10 А. Правильно. Б. Неправильно. Липидные бислои внутренней и наружной ядерных мембран на краю каждой ядерной поры переходят один в другой.
В. Правильно. Г. Неправильно. Для экспорта нз ядра, судя по всему, тоже тре- 366 Глава 8 буются специальные системы узнавания и источники энергии, как и для импорта в ядро. Д. Правильно. 8-11 А. Часть молекулы нуклеоплазмина, ответственная за его вхождение в ядро, должна находиться в хвостовой части молекулы. Действительно, головки нуклеоплазмина не попадают в ядро при микроинъекции их в цитоплазму, а это единственный иньецированный фрагмент, нс содержащий хвостовой части молекулы. Б.
Результаты этих опытов позволяют предполагать, что хвостовая часть молекулы нуклеоплазмина несет сигнал для импорта в ядро н что накопление в ядре не обусловлено пассивной диффузией. Данные, полученные в тех вариантах опыта, где были инъецированы целые молекулы нуклеоплазмина или его фрагменты, содержащие хвостовой пептид, не позволяют сказать, какая из двух моделей верна; они указывают лишь на то, что хвост является важной частью молекулы нуклеоплазмина, т.е.
что он несет сигнал для импорта или участок связывания. Решающие наблюдения, свидетельствующие против механизма пассивной диффузии, относятся к опытам с головками нуклеоплазмина. То, что они ие накапливаю~ел в ядре после инъекции в цитоплазму, можно было бы объяснить !в случае механизма пассивной диффузии) отсутствием участка связывания с неким ядерным компонентом. Если, однако, головка не содержит участка связывания, то она не могла бы оставаться в ядре и после введения непосредственно в него. Поскольку головка остается в ядре, можно было бы предположить, что ее размер слишком велик для прохождения через ядерную пору.
Однако более крупные фрагменты нуклеоплазмина проходят через ядерные поры, поэтому возможность пассивной диффузии этого белка следует, по-видимому, исключить. Литература: О!лджаИ, С., Яяаггясь, К Р, г.агяеу, Я.А. А ро!урерггде дотла!и !па! зресрйеа пиятабоп о! пис!еор1азппп !пго гЬе пас!ела. Сей 30, 449 — 458, 1982. 8-12 Смысл эксперимента заключается в том, что если рестриктаза ЕсоК1 попадет в ядро, она будет расщеплять клеточную ДНК на части, что приведет к гибели клетки, В среде с глюкозой гибридный ген не транскрибируется и продукт его не образуется, поэтому клетки растут очень хорошо. Однако в присутствии галактозы гибридный геи экспрессируется. В дрожжевых клетках, несущих плазмиду рХЬ, которая кодирует нефункциональный сигнал для импорта в ядро, гибридный белок хотя и экспрессируется, но не может войти в ядро, поэтому он не вредит клетке. Однако в дрожжах с плазмидой рМ).
~, которая кодирует функциональный сигнал для импорта, гибридный белок попадает в ядро и разрезает клеточную ДНК, в результате чего клетки погибают. Литературы Ваглеа 6., Вие, .!. Кехи!агед ехргемюп ог еидопис1еазе ЕсоК1 1п Яассяагоглусег сегеегг1ае: пис!еаг епггу апд 1ло!ох!си! сопаег1иепсеа.
Ргос. Ха!1. Асад. Ясй !ЗЯА. 82: 1354 — 1358, 1985. 8-13 А. Существенным недостатком вашего исходного плана является то, что белок-убийца, образовавшийся в клетках при высокой температуре, но не имеющий возможности проникнуть в ядро у мутантов (дефектных по механизму переноса), по-прежнему будет присутствовать в клетках и после перенесения их в условия Внутриклаточнал сортировка макромолакул 367 Б. В. Транспорт белков в митохондрии и хлоропласты 8-14 А. матрикс; внутренняя мембрана; межмембранное пространство; наружная (внешняя) мембрана низкой температуры.
Когда ядерный транспорт возобновится при пониженной температуре, белок-убийца начнет проникать в ядро, и мутантная клетка погибнет. Ваш первоначальный протокол таран~провал, что никакого нового белка-убийцы не должно образовываться (под влиянием сдвига температуры в сторону снижения и в присутствии глюкозы в среде), но в нем не учитывалось, что часть этого белка-убийцы уже была образована в присутствии галактозы, еще до снижения температуры.
Вам следует изменить свой экспериментальный протокол так, чтобы ранее синтезированный белок-убийца перешел бы в неактивную форму до того, как возобновится импорт в ядро. Для этого есть много путей. Например, можно оставить клетки при высокой температуре в среде с глюкозой (когда не идет новый синтез) в течение длительного срока, чтобы весь ранее синтезированный белок инактивировался в результате обычных процессов деградации.
Можно было бы также попытаться увеличить скорость такой деградации, модифицировав 1Ч-конец белка-убийцы так, чтобы там оказалась дестабилизирующая аминокислота (см. задачу 8-6). Такая модификация могла бы превратить белок- убийцу в чрезвычайно корол.коживущую молекулу, быстро исчезаюшую при отсутствии нового синтеза. И наоборот, можно было бы использовать чувствительный к температуре мутант, у которого Есой1 активна при высокой и неактивна при низкой температуре. Такой чувствительный к холоду белок окажется активным, когда ядерный транспорт подавлен, и неактивным, когда транспорт возобновляется. Есть несколько типов мутантов, которые, по-видимому, могли бы выжить в ходе отбора, не претерпевая изменений в механизме ядерного транспорта. Например, у мутантов с нарушением транспорта галактозы в клетку гибридный ген не действовал бы, и в результате они выжили бы при повышении температуры в присутствии галактозы. Выжили бы в процессе отбора и мутанты с гибридным геном, у которых отсутствовала бы экспрессия Есой1.
Это могли быть клетки, которые содержат мутации в промоторе (препятствуюпше экспрессии гибридного гена), или мутации в Есой!-части гибридного гена (делающие ЕсоК1 неактивной), или же мутации в той области гибридного гена, которая ответственна за сигнал для импорта в ядро (препятствуюпгие импорту ЕсоЫ в ядро). Схемы генетического отбора редко бывают абсолютно специфичными для искомого мутанта. В некоторых случаях могут быть предсказаны, а затем выявлены и другие классы мутантов. В действительности, однако, наиболее увлекательная сторона генетического отбора, которая придает ему сходство с охотой за сокровищами, как раз и заключается в том, что часто можно выявить такие классы мутантов, которые вы и не предполагали обнаружить.
Иногда оии оказываются тривиальными и неинтересными; однако попадаются также чрезвычайно интересные и информативные мутанты, благодаря которым можно открыть нечто совершенно неожиданное. 368 Глава 8 8-15 А Пептид 1 тт Е в !г е 1 е Л Ю К В и и т 1 И г г !е „!з !7 !и 3 Ф и зр .'.1! Б Пептид 2 Ю тд 8 !г 1 в е а Ю 4 Л Ю 11 Л .и г !в в Ю и !7 ю 3 Т тб „-.й В Пептид 3 % и % гг 1 в ты Ю 1б 4 и к г 11 'А' г 14,'11 . !з 7 .й! атз е д 17 !е З и 81 !й Рде. 8-21. Спирально-круговые проекции трех пептидов (ответ 8-)7). Гндрофобные аминокислоты отмечены затемненными квадра- тами; заряды на заряженных аминокислотах указаны в кружках; незаряженные галрофильные аминокислоты не имеют дополни- тельных обозначений.
Б, тилакоидная мембрана; тилакоидное пространство В. митохондриальные белки-предшественники Г. участки контакта Д. тилакоид А. Неправильно. Белки, закодированные в геноме митохондрий, действительно локализованы в основном во внутренней митохондриальной мембране, однако белки, закодированные в геноме хлоропласгов, локализованы главным образом в тилакоидной мембране. Б. Неправильно. Митохондриальные сигнальные пептиды представляют собой амфипатические спиральные структуры с положительно заряженными аминокислотами на одной стороне и незаряженными гидрофобными аминокислотами на другой стороне спирали. В. Правильно.
Г. Правильно. Д. Правильно. Е. Правильно. Ж. Неправильно. Через поры в наружной мембране митохондрий свободно проходят лишь молекулы с мол. массой ниже 10000 Да. Большинство белков имеют более крупные размеры, поэтому наружная мембрана представляет собой преграду для их проникновения, 3. Неправильно. В митохоидриях элекгрохимический протонный градиент используется как движущая сила для импорта белков.
В хлоропластах же такой градиент генерируется на тилакоидной мембране, поэтому он не может использоваться для импорта белков через наружную и внутреннюю мембраны. 8-16 Обычно трансляция происходит гораздо быстрее, чем импорт в митохондрии, так что синтезированные белки полностью отделяются от рибосомы, прежце чем начинают взаимодействовать с мембраной митохондрии. Когда белковый синтез блокирован циклогексимндом, скорость трансляции становится ниже скорости импорта.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
