Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Часто наблюдаемая мутация вируса приводит к изменению морфологии бляшки. Мутанты бактериофага Т4, называемые г-мутантами, были сначала открыты по их способ- А. Каков был начальный титр Т4 сразу после его смешивания 36 Глава б ности быстрее других образовывать бляшки в «газоне» Е. соб (здесь «г» обозначает быстрый лизис). Один из классов г-мутантов, а именно гл-мутанты, не образует бляшек в культуре Е срй штамм К. Эти мутанты начинают инфекцию у Е со(!', но она носит характер абортивной, и вирусы не размножаются. Особая морфология бляшек гл-мутантов в культуре Е'.
соб В, а также их неспособность расти на Е. соб К были виртуозно использованы в ранних опытах по изучению основных механизмов мутирования генов и установлению триплетной структуры генетического кода. Для практического знакомства с этими классическими исследованиями вам дали восемь га-мутантов, которые нужно охарактеризовать. Сначала вы ставите ряд тестов на образование бляшек.
Вы заражаете одну пластинку агара с Ь'. сод К мутантом 1, взятым в высокой концентрации, а вторую пластинку — мутантом 2 в высокой концентрации, так что много бактерий на каждой пластинке становится зараженными. Затем вы наносите по капле одного мутанта или фага Т4 дикого типа в кружки, расположенные по окружности пластинки. В качестве контроля вы наносите мутантные фаги и фаг Т4 дикого типа на «газон» незараженных бактерий Е срй К. После инкубацин в течение ночи вы получаете результаты, показанные на рис. 5-32. Эти результаты определенно кажутся информативными, но вам не все ясно.
Чтобы определить, какой вид фага находится в прозрачных кружках, вы отбираете некоторое количество фагов из пятна, образованного фатом дикого типа, и из прозрачного пятна, образованного мутантом 5, и исследуете нх рост. Фаги нз пятна с фатом дикого типа образуют нормальные бляшки и на Е. соб В, и на Е. срй К, как и ожидалось. Большинство фагов из пятна, образованного мутантом 5, ведут себя по-прежнему как мутанты: они образуют г-бляшки на Е. со1! В, но не растут на Е.
сой К. Однако некоторые фаговые частицы из пятна, образованного мутантом 5, по-видимому, относятся к дикому типу: они образуют нормальные бляшки на обоих штаммах Е. Еой. Частота встречаемости фатов дикого типа слишком высока, чтобы она могла определяться обратным мутированием (обращением мутации), которое происходит, но с частотой всего от 10 ' до 1О ь. А. Почему некоторые смеси мутантиых фатов растут в кружках, а другие нет? Б.
Какую картину роста следует ожидать, если повторить тест с кружками, используя Е. со)т, зараженную мутантом 3? В. Насколько возросла небольшая фракция фага Т4 дикого типа в прозрачном пятне, образованном мутантом 5? 5-42 Вы выделили из животных клеток три разных вируса. Каждый из них содержит одноцепочечную РНК в качестве генома. Чтобы Нормальный рост бактеРий Проаранное лиане (нет бантерналмюго рост ! Рис.
5-33. вирусной клетках ( Неинфииированные клетки Е.соу! К Клетки Е. сЫ! К, ил(тли«равеннам мутантом! Клетки Е, сор К, инфигмрованньм мутантом З Рве. 5-32. Тест с кружками лля разных тл-мутаатов (залача 5-4!). Основные генетические механизмы 37 охарактеризовать, вы исследуете их с помощью двух тестов.
Во-первых, вы очищаете РНК-геномы этих вирусов и определяете их способность служить мРНК в бесклеточной системе синтеза белка, Во-вторых, вы измеряете активность их зндогенных полимераз, для чего разрушаете мягким способом ннтактные вирусные частицы, затем инкубируете их либо с радиоактивными рибонуклеозидтрифосфатамн, чтобы определить синтез РНК, либо с радиоактивными дезоксирибонуклеозндтрифосфатами, чтобы определить синтез ДНК. Результаты этого исследования представлены в табл. 5-2. Попробуйте на их основе кратко описать жизненный цикл каждого вируса и назовите какой-либо известный вирус с таким же циклом развития. Таблица 5-2. Характеристика трех РНК-содержащях вирусов (задача 5-42) Синтез белка Эядогеаяая ролямераза РНК ДНК Вирус ! Вирус 2 Вирус 3 ста ств Линейное ыолектла ДНК клетки- Ряс.
5-33. Разные формы ретро- вирусной ДНК в инфицированных клетках (задача 5-43). каалкна Интегрированный лроанрто 5-43 Когда ретровирусы заражают клетки, их геном, представленный линейной молекулой РНК, копируется с образованием линейной двухцепочечной ДНК при участии вирусного фермента-обратной транскриптазы. Эта линейная ДНК содержит вирусные гены, «вставленные» между двумя прямыми повторами, называемыми длинными концевыми повторами, или ЬТй (рис.
5-33). Линейная ДНК может стать кольцевой в результате гомологичной рекомбинации между ЬТВ, при этом в кольце будет содержаться один ЬТй, либо она может стать кольцевой в результате сшивания концов, в этом случае в кольце будет содержаться два ЬТК. Одна из форм внехромосомной ДНК встраивается в хромосому, и образуется типичная интегрированная форма вируса, которая всегда содержит два ЬТК, по одному с каждой стороны от вирусных генов.
Хотя точный механизм интеграции неизвестен, делеция последовательностей на концах ЬТк препятствует интеграции, что указывает на важную роль по крайней мере части структуры ЬТК. Поскольку есть три формы неинтегрированной ДНК, то любая из них или все три могли бы быть предшественниками интегрирован- 38 Глава б г о л н с и П из це Структуре сконструироввнных ретровирусных геноыав Электрофорев в геле интегрнровенных ретровирусав 8 т.п.н.— — -ы о,в О,е 8 т.п.н.
Ге 0,8 0,4 0,4 т.п.н. Рис. гете в рез тур бвкте Тп Го изоб виде ные тами ными Рис. 5-34. Структура сконструиро- ванных ретровирусных геномов и анализ интегрированных форм генома после заражения (задача 5-43). Диагностические санты рест- рикции указаны кружками и квад- ратами. Числа обозначают длину сегментов ДНК в т.п.н. 8 т.п.н. О,а О,4 0,8 т.п.н. ной формы.
Чтобы выяснить, какая форма является предшественникомм, для заражения клеток были использованы три разных ретровнрусных генома. Эти геномы представлены в виде линейной ДНК на рнс. 5-34; А — нормальный геном, Б-геном с одним внутренним 1.ТК н В- геном с двумя внутренними 1 Тй, ферментатнвно сшитыми конец в конец. После заражения каждым геномом исследовали популяции клеток, содержащих интегрированные вирусные геномы. Из трех клеточных популяций выдслялн хромосомную ДНК н обрабатывали ее диагностическими рестрнктазами, которые расщепляют вирусную ДНК, как показано на рис.
5-34. Получившиеся фрагментьг ДНК разделяли с помощью электрофореза в геле и фрагменты, содержащие ДНК ретровирусов, исследовали методом гибридизации с меченым зондом, специфичным для последовательностей ретровирусов. Эти результаты представлены на рис.
5-34 справа. Те фрагменты, в которых кроме последовательностей рстровнрусов содержалась клеточная ДНК, на рисунке не показаны. Пользуясь этими данными, попытайтесь установить структуру предшественника интегрированной формы вируса и объясните ваше решение. Основные генетические механизмы 39 Рис. 5-35.
Рспликативиая и нсрспликативиал траиспозиция подвижного элемента (задача 5-44). Подвижный элемент показан как гстсродуплскс, состоящий иэ двух генетически различающихся цепей- одна обозначена черным цветом, другая белым. В ходе рспликативпой транслозиции одна цепь остается в лоиориой ДНК, а другая переносится в ДНК реципиента. При нсрспликативиой траиспсэицаи подвижный элемент вырезается из допориой ДНК и переносится целиком в ДНК реципиента.
Тп!0 1асг+ тпщ 1мх— Данатурацин, реотжнг Гатародуплакс Гомодуплакс Рис. 5-36. Образование смеси гсгсродуплскссв и гомолуплсксов в результате лсиатурации и ренатурации двух различных гсиомов бдктсрнсфага лямбла, содержащих Тс10 (задача 5-44). Фаговая ДНК изображена линиями, а Тп10-и виде прямоугольников. Мутапиоиаыс различия между двумя элсмсатами Тп10 показаны белыми и черными сегментами. т 1о ДНК кпатки-лозинка Нарапликатианая згс, Рапликатианая транспозиинн "~тараяспозиция Вы изучаете транспозон Тп!0, существующий в прокариотических клетках, и придумали изящный эксперимент, с помощью которого можно выяснить, реплицируется ли Тп!0 во время транспозиции или перемещается безотносительно к репликации ДНК.
Ваша идея основана на ключевом различии между этими двумя механизмами: если транспозиция нерепликативная, то должны перемещаться обе родительские цепи Тп10, если же транспозиция репликативная, то должна перемешаться только одна родительская цепь !рис, 5-35). Вы собираетесь пометить отдельные цепи денатурированными цепями из двух различных Тп10. Чтобы эффективно вводить эти гетеродуплексные Тп10 в бактерии, вы используете ДНК бактериофага лямбда, содержащую Тп10. Такая ДНК может быть приготовлена щ уйго, а затем упакована в капсиды, чтобы образовался фаг, способный инфицировать клетки. Вы используете неактивный 1по причине других мутаций) фаговый геном, так что он нс может рсплицироваться или встраиваться и в конце концов разрушается; таким образом, вкладом этого фагового генома можно пренебречь. ДНК фага несет два слабо различающихся варианта Тп!0, встроенные в один и тот же сайт.
Оба Тп10 содержат ген устойчивости к тетрациклину и ген метаболизма лактозы (!ас2), но в одном из вариантов ген !асУ инактивирован в результате мутации. Благодаря этому различию можно следить за двумя транспозонами Тп10, так как колонии бактерий с геном !асУ' (если они инкубируются с соответствующим субстратом) становятся синими, а колонии бактерий с геном !асХ остаются белыми. Вы денатурируете и затем ренатурируете смесь двух фаговых ДНК, в результате чего образуется смесь равных количеств гетеродуплексов и гомодуплексов (рис.
5-Зб). Затем вы осуществляете упаковку этой смеси в фаговые капсиды, заражаете !асУ -бактерии и производите посев инфицированных бактерий в чашки Петри на среду, содержащую тетрациклин и субстрат, дающий окраску. Если фаговая ДНК оказывается внутри бактерии, транспозон может встраиваться !с очень низкой частотой) в бактериальный геном, которому он передает свойство устойчивости к тетрациклину. Те немногие клетки, которые приобретают Тп10, выживают в селективных условиях и дают колонии.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
