Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 8
Текст из файла (страница 8)
5-25. В качестве дополнительного контроля образец 3'й,инкубированный с гесВС)3, был подвергнут электрофорезу в геле без предварительной денатурацнн (рнс. 5-25). А. Какие данные указывают на то, что гесВС(3 разрезает ДНК в Хи-сайте? Разрезает ли он одну илн обе цепи? Если вы решите, что разрезается только одна цепь, определите эту цепь н объясните ваше решение, Б. Какие данные указывают на то, что гесВС(3 может действовать как гелнказа, т.е.
что он может разделять цепи дуплексной ДНК? В. Каким образом гесВС)3 мог стимулировать гомологнчную рекомбинацню в окрестности Хн-сайта? в с о д з в о С::) 5-33 Бактериофаг Т4 кодирует ЯЗВ-белок, связывающий одноцепочечную ДНК и играющий важную ро.ць н рекомбинации и репликации ДНК. У мутантов Т4, имеющих температурочувствнтельную мутацию в гене, кодирующем %В-белок, рекомбннация и репликация быстро прекращаются прн повышении температуры. Синтезируемый ББВ-белок — это мономерный белок удлиненной формы с мол. массой 35000. Он прочно связывается с одноцепочечной ДНК, но не взаимодействует с двухцепочечной ДНК.
Связывание насыша- Рне. 5-23. Разнообразие субстратоа рекомбинации (задача 5-31). Рне. 5-24. Фрагмент линейной ДНК, солержащий Хи-цайт, (задача 5-32), Приведена последователь- ность оснований Хи-сайка. Буквами !. и й обозначены левый и правый концы этого фрагмента. 100 нукнеатидаа астаатаа з еакссаес з Хи-екйт н з' 30 Глава 5 гесвео — + + + + + Киппчение + + + + + Меченый па 5'Ь 5''с 5'Я 3'Ь 3'В 3'а Месте нанесение А Б В 1 2 3 4 5 6 рис. 5-26? Рве. 5-25. Результаты внкубации гссВСО-белка с содержащими Ха-саят фрагментами ДНК, в которых были помечены концы определенных цепей (задача 5-32).
Числа, относящиеся к полосам, указывают длину меченого фраг- мента (в нуклеотидах). Вес пробы перед элехтрофорсзом были дена- турированы, кроме пробы 6, кото- рую вс подвергали кипячению. Рвс. целе аост Одв (+) дине (+)- Рве. разде тов к с тес карта моле к 3'-к Я 0,5 мкг ББВ Б 7,0 мкг ББВ О,4 ст о,з З0О х х с 200 Ф 1ОО с и 0,1 ж г о Низ Низ Верх Верх Рвс. 5- банан Нзпреепение седиментеции Рве. 5-26. Свжзываиие 55В-белка фага Т4 с однопепочечвой ДНК (задача 5-33). Связывание определяли с помощью пеитрифугирования в градиентах сахарозы, в которых ДНК, имеющая ббльщую массу, оседает быстрее, чем белок, и поэтому обнаруживается ближе ко хну пробирки.
ется при весовом соотношении ДНК:белок, равном 1:12. Для этого взаимодействия характерна особенность, которая проиллюстрирована на рис. 5-26. При избытке одноцепочечной ДНК (10 мкг) и количестве ВБВ-белка 0,5 мкг связывания не наблюдается (рис. 5-26, А), тогда как при количестве ББВ-белка 7 мкг происходит почти количественное связывание (рис.
5-26„Б'). Каково отношение числа нуклеоэидов одноцепочечной ДНК к числу молекул БВВ-белка при насьпцении связывания'! (Средняя мол. масса одного нуклеотида равна 330.) Контактируют ли соседние мономеры БВВ-белка, когда реакция его связывания с ДНК достигает насыщения? Исходите из того, что при связывании мономер ББВ-белка тянется на 12 нм вдоль молекулы ДНК и что пространственное расположение оснований в одноцепочечной ДНК после связывания с ВВВ-61елком остается таким же, как н в двухцепочечной ДНК (т.е.
10 нуклеотидов на 3,4 нм). Как вы считаете, почему связывание ББВ-белка с одноцепочечной ДНК так сильно зависит от количества ББВ-белка, как показано па Белок гесА катализирует как начальный этап рекомбинации-спаривание, так и последующую миграцию ветвей у Е сой. Он способствует рекомбинации, связываясь с одноцспочечной ДНК и каталнзируя спаривание такой покрытой белком цепи с гомо- логичной двухцепочечной ДНК. Можно определить действие гесА по образованию кольцевых двухцепочечных ДНК в смеси из двухцепочечных линейных молекул ДНК и гомологичных им одноцепочечных кольцевых ДНК, как показано на рис. 5-27.
Зта реакция протекает в два этапа: сначала кольцевая ДНК спаривается с линейной молекулой на одном из ее концов, а затем точка ветвления продвигается по линейной двухцспочсчной ДНК, пока от нее не отделима линейная однопепочечная ДНК. Для понимания процесса с участием гесА важно знать, происходит ли перемещение точки ветвления в строго определенном направлении. Этот вопрос был изучен следующим образом. Одноцепочечные кольцевые молекулы ДНК, равномерно меченные фосфором 33Р, смешивали с немеченымн двухцепочечными линейными молекулами ДНК в присутствии гесА.
Как только одноцепочечная ДНК спаривается с линейной ДНК, она становится чувствительной к действию рестриктаз, которые не разрезают одноцепочечную Основные генетические механизмы 31 Ойнсцепочечная капнцевая ДНК О ДНК. Отобрав пробы в разные моменты инкубации, обработав их рестриктазами и разделив меченые фрагменты с помошью элекгрофореза, получили результат, схематично представленный на рис.
5-28. А. Сравнивая время появления меченых фрагментов с картой рестрикции кольцевой ДНК на рис. 5-28, сделайте заключение, какой конец (5' или 3') ( †)-цепи линейной ДНК захватывает кольцевая (+)-цепь. Попытайтесь также определить направление миграции ветвей вдоль (-)-цепи. (Линейная двухцепочечная ДНК была разрезана по границе между фрагментами а и с, см, карту рестрикции на рис. 5-28, Б.) Б. Рассчитайте скорость миграции ветвей, принимая длину этой ДНК равной 7 т.
п.н. В. Что произойдет, если линейная двухцепочечная ДНК получит вставку из 500 пегомологнчных нуклеотидов между рестрикционными фрагментами е и а? Двухцепочечнан пинейнан ДНК 5-35 Два гомологичных родительских дуплекса и два набора потенциально возможных продуктов их рекомбинации схематически изображены на рис. 5-29.
Изобразите сформированное родительскими дуплексами соединение Холлидея, которое могло бы давать указанные продукты рекомбинации. Пометьте левый конец каждой цепи в соединении Холлидея как 5' или 3', так чтобы было попятным его соотношение с родительскими и рекомбинантными дуплексами. Ответьте, какие цепи следует разрезать, чтобы получить каждый набор продуктов рекомбинации. Наконец, изобразите графически, как должны выглядеть эти продукты после одного цикла репликацни. Двухцепочечная кольцевая ДНК с разрывом в айной цепи Опнацепочечнан пинейнан ДНК Ряс. 5-27.
Мотал ассимиляция цепей ДНК для определения актив- ности гесА-белка (звдача 5-34). Однодспочечнвя кольцевая ДНК (ф) коыплсмснтарна ( †)-цепн линейного дуплекса н идентична (4)-депн этого дуплекса, д. Эпектрофоретическое разнепение меченых рестриктав Б. Карта рестрикции виру айДНК Ф а4 Ь б' -т 3' в а Ряс.
5-28. Электрофорстнчсскос разделение (А) меченых рестряк- тов хах функция времени иакубацяя с гесА (задача 5-34). Приведена карга рестрикции (Б) для кольцевой молекулы;направление ат 5ч х Зчконпу -по часовой стрелке. О 2,$ $7,$ 1О 12,$1$ 2О 2330 Время. мин $' 3 Рнс. 5-сн. Родительские н рскомбинватныс дуплексы (задача 5-35). з 5-3б Когда плазмидную ДНК из Е сой исследуют с помощью электронного микроскопа, ббльшая часть плазмид имеет вид моно- 32 Глава 0 С) Рне.
5-30. Плазмндные молекулы, наблюдавшиеся до обработки рестрнктазой, вводящей единичные разрывы,(А) н после такой обра- ботки (Ь') (залача 5-36). л до рестрикции Форме "еосемерки" (яимер) Б Пассе рестрикции Пииеяиме маиекуиы мерных колец, но встречаются и другие формы, например димерные и тримерные кольца. К тому же около 1% молекул имеют вид восьмерок, у которых обе петли одинаковы (рис. 5-30, А). Вы предполагаете, что эти «восьмерки» представляют собой промежуточные продукты рекомбинации с образованием димера из двух мономеров (или двух мономеров из димера). Чтобы выяснить, что это — скрученные димеры или просто соприкасающиеся мономеры, вы обрабатываете препарат ДНК ферментом рестрикции, который разрезает в единственном сайте в мономере, и вновь исследуете молекулы. После рестрикции обнаруживаются только две формы: 99% молекул ДНК имеют форму линейных мономеров и 1% — )(-форму (рис.
5-30, Б). Вы замечаете„что )(-форма обладает примечательным свойством: два длинных плеча имеют одинаковую длину так же„как и два коротких. К тому же сумма длин короткого и длинного плеч равна длине мономерной плазмиды. Однако положение точки перекрещивания совершенно случайное. Не будучи полностью уверенным в себе и чувствуя, что, по-видимому, допущена какая-то ошибка, вы показываете ваши снимки коллеге. Он считает, что вы видите промежуточные продукты рекомбинации, которые возникают при спаривании случайным образом по гомологнчным сайтам. А, Прав ли ваш коллега? Каков ход его мыслей? Б.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
