Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Какие компоненты Тесгийутепа вероятнее всего необходимы для эффек- тивной трансляции мРНК ТесшЬутепа? 1 2 3 4 $ Рвс. 5-1. Трансляция мРНК ВТМ в присутствии и в отсутствие разных компонентов Тсптьулкта (задачв 5-5). Г. Объясните значение результатов ваших экспериментов с эволюционной точки зрения. дикий тип: 1х) М 1Ц С К„ мутант: )х)М 1%О1СУМКО. А. В чем заключалась мутация, приведшая к сдвигу рамки? Б. Определите количество аминокислот в новосинтезированном фер- 12 Глава б Рве. ВТ Рве. 5-2.
Синтез а- и Р-глобвпа (задача 5-6). х я 2000 я х и' С 1 000 С О х Я й мяп д ды геля 0 20 40 80 80 100 120 140 ЧИСЛО ВМИИОИИСЛОТ й 3 й Ряс. тео резу (з Ряс. 5-3. Гипотетические кривые синтеза глобява прв блокировании движения рвбосом ва середине молекулы мРНК (задача 5-6). ЧИСЛО ВМИИО ВИСЛ ОТ ЧИСЛО ВМИИОИИСЛОТ ЧИСЛО ВВМИОИИСЛОТ 5-6 Проанализируем эксперимент по изучению координированного синтеза а- и 1)-цепей гемоглобина.
Ретикулоциты кролика подвергали мечению 'Н-лизином в течение 10 мин, т,е. достаточно долго по сравнению с продолжительностью синтеза единичной цепи гемоглобина. Затем с помощью центрифугирования выделяли рибосомы с прикрепленными к ним растущими полипептидными цепочками, так чтобы в полученном препарате не было свободных (растворенных) цепочек полностью синтезированного глобина.
Растущие цепочки обрабатывали трипсином, в результате чего получались пептиды с лизином или аргиннном на С-конце. Эти пептиды затем разделяли с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии и определяли их радиоактивность. График уровня радиоактивности для каждого пептида в зависимости от положения остатков лизина в цепи представлен на рис.
5-2. А. Позволяют ли такие данные сделать заключение о том, какой конец цепей глобина синтезируется первым? Каким образом? Б. В каком соотношении синтезируются а- и 13-цепи глобина? Можно ли по этим данным оценить относительное количество молекул мРНК для а- и ~3-глобина? В. Как долго белковая цепь остается прикрепленной к рибосоме после того, как трансляция достигает кодона терминации? Г. Ранее предполагалось, что тем присоединяется к растущим глобиновым цепям во время их синтеза и что синтез полипептидной цепи на рибосоме приостанавливается на время присоединения к ней гемовой группы. Прямые линии на рис.
5-2 указывают на то, что синтез на рибосомах протекает без заметных пауз, и теперь считают, что гем прикрепляется к уже готовой цепи. Выберите из графиков на рис. 5-3 один, который указывал бы на значительную остановку рибосомы где-то в середине ее движения по мРНК. Основные генетические механизмы 13 Рис. 5-4. Динамика синтеза белка ВТМ а лизате ретикулоцитоа кролика (задача 5-7). В первые три минуты радиоактивность ие определяли, поскольку короткие иептиды выходили за пределы столбика геля. то !5 20 25 ЭО М„, к 115 97 ао Зт 5 и 15 2О 25 Время отбора пробы, мии иа ж Фактический резулчтат йыв е 55 о и Время и. Теоретический результат $0. к Ва и ВВ е о и Время 5-8 Кодоны термннации у бактерий узнаются одним из двух белков: фактор 1 (КГ1) узнает ПАСТ и 1)АА, фактор 2 (КГ2) — 1)СтА и 1)АА. Молекулярные механизмы узнавания этими белками стоп-кодонов н окончания синтеза полнпептидной цепи пока неизвестны.
В то же время недавно были клонированы и секвенированы гены для факторов 1 и 2. Прн сопоставлении нуклеотидной последовательности гена для КЕ2 с аминокислотной последовательностью этого белка был обнаружен неожиданный результат, относяацийся к последовательностям, приведенным под картой гена на рис. 5-6. Последовательности этого гена и белка были тщательно проверены, чтобы исключить возможность каких-либо ошибок.
Рае. ~5. Фактические (А) и теоретически предсказанные (Б) результаты опыта ~о синтезу белка (задача 5-7). 5-7 Скорость роста пептидных цепей можно оценить по данным, представленным на рис. 5-4. В этом опыте единственный вид мРНК ВТМ, кодирующей белок массой 116000 Да, транслировался в лизате ретикулоцитов кролика в присутствии зая-метионина. Пробы отбирали с интервалами в одну минуту и анализировали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. Продукты трансляции определяли с помощью радиоавтографии. Как следует из рисунка, размер наиболее крупных пептидов увеличивается с продлением периода трансляции.
А. Линейна ли скорость синтеза во времени? Простой способ оценки линейности скорости синтеза в этом опыте заключается в том, чтобы мол. массы стандартных пептидов, отмеченные по оси ординат на рис. 5-4, отложить на графике против моментов времени, когда в пробе сннтезировались наиболее крупные пептиды, равные им по массе. Б. Какова скорость синтеза белка (число аминокислот/мин) в этом эксперименте? Исходите из того, что средняя мол. масса аминокислоты равна 110. В. Почему на радиоавтограмме так много полос и количество их продолжает возрастать с продлением периода трансляции, т.е.
почему на практике получается такой «действительный» результат, а не «теоретический», изображенный на рис. 5-5? Можете ли вы придумать такие экспериментальныс условия, которые привели бы к получению «теоретической» кривой? 14 Глава б Рис. 5-6. Схематическое изображе- иие гена ддх белка йг? (задача 5-8). Кодирующая последовательность изображеиа жириой линией; приве- деиы оосдедоиатедьиоетяиукдеоти- дов иа ее коипевых участках.
А Р 6 * осхссоооотхо м г к АТ6ТТТСАААТТ 1500 1000 666ТАТСТТТ6АСТАС6АС6СС 6 Т Ь 0 Х 0 И Измерить общую точность белкового синтеза чрезвычайно труд- но. Это объясняется отчасти тем, что его точность очень высока и, следовательно, ошибки крайне редки, а также тем, что клетки обычно быстро ликвидируют допущенные ошибки. Существуют и технические проблемы. Например, насколько точно можно идентифицировать какой-либо белок, безусловно отличающийся от белка, для которого вам известны условия очистки и критерии идентификации? Один остроумный подход к этой проблеме основан на использовании белка флагеллина (мол.
масса 40000), который заведомо является единственным белком бактериальных жгутиков. Флагеллин обладает двумя достоинствами. Во-первых, жгутик (а следовательно, и флагеллин) может быть отделен от клеток бактерий и очищен с помощью дифференциального центрифугирования. Во-вторых, в этом белке нет цистеина, что позволяет с высокой точностью определить ошибочное включение цистеина в белок.
Бактерии метили "ЯО4 [уд, активность 5,0 х 10 имп1'(мии х х пмоль)) в пределах точно одной генерации и при избытке немеченого метионина (в этих условиях отсутствует какое-либо включение радиоактивности в метионин). Образованный в результате флагеллин был очищен и подвергнут электрофорезу в полиакриламидном геле, В 8 мкг флагеллина, выделенного из геля, содержалось 300 имп/мнн 558-радиоактивности. А.
Какая доля молекул флагеллина, синтезированных в период ме чения, содержит цистеин? Считайте, что количество флагеллина удваивается за период мечения и что удельная активность цистеина во флагеллипе равна удельной активности 158О „используемой для мечения клеток. Б. Во флагеллине цистеин ошибочно включается по аргининовым кодонам СОП и СОС. Объясните на основе взаимодействия кодон-антикодон, какая ошибка совершается при неправильном включении цистеина вместо аргинина? В. Если считать, что во флагеллине содержится 18 молекул аргинина и что все кодоны аргинина равноправны, то какова частота ошибочного считывания каждого чувствительного кодона аргини- на (ССТ1) и СОС)? Г.
Предполагая, что частота ошибки в расчете на один кодон, рассчитанная в пункте В, одинаково приложима к кодонам всех А. В чем состояла неожиданность результата? Б. На какое предположение относительно регуляции экспрессии гена белка 1(г2 наталкивают зти данные? 5-10 е з а в в Время, мии Рве. 5-7. Действие ингибиторов эдеива и дкклогексимида на синтез белка в дизатах ретикулонатов (задача 5-10).
,3 Е я Ь 2 3 $ Основные генетические механизмы Зб аминокислот, определите долю молекул, которые синтезируются правильно, для белков длиной в 100, 1000 и 10000 аминокислот. (Вероятность безошибочного кодирования равна единице минус вероятность ошибки.) Вы выделили из культуры бактерий антибиотик эдеин.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
