Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 6
Текст из файла (страница 6)
Та дочерняя цепь ДНК, которая при репликации сннзезируегся непрерывно, называется , а та цепь, которая синтезируется с перерывами, Е. Для ДНК-полимеразы в отличие от РНК-полимеразы совершенно необходим свободный 3'-ОН-конец , спаренной с расплетенной ДНК, чтобы присоединять к нему новые нуклеотиды. Ж. Если ДНК-полимераза ошибочно присоединит неправильный нуклеотид к Зчконцу, ее отдельный каталитически активный домен, обладающий (3'- 5')- активностью, удалит неподходящее основание. 3, Для инициации синтеза ДНК на отстающей цепи нужны короткие праймеры, возникающие благодаря работе фермента которая в качестве субстратов использует рибонуклеозндтрифосфаты.
И. Расплетание двойной спирали ДНК в зоне репликативной вилки катализнруется , использующей для направленного движения по ДНК энергию гидролиза АТР. К. Способствующие расплетанню ДНК связываются с одноцепочечной ДНК таким образом, что основания становятся доступными для реакции матричного синтеза. Л. Если ДНК-полимераза ошибается при образовании пары оснований, соединенных друг с другом водородными связями, то ошибка исправляется специальной системой (репарации повреждений), которая отличает новые цепи от старых по признаку метилирования.
М. Для бактерий и некоторых вирусов, инфицирующих эукариотические клетки, было показано, что реплнкационные глазки образуются в тех участках молекулы ДНК, где находятся специальные последовательности, называемые Н. можно рассматривать как «обратимые нуклеазы», которые создают либо кратковременный одноцепочечный разрыв (тип 1), либо кратковременный двухцепочечный разрыв (тнп 11). 5-21 Укажите, какие из следующих утверждений правильные, а какиенет. Если утверждение неверно, объясните почему. А. У Е. сей репликативная вилка продвигается вперед со скоростью Основные генетические механизмы 23 500 п.
н. в секунду, а цепи ДНК перед вилкой вращаются с круговой скоростью почти 3000 об(мин. Полуконсервативная репликация означает, что родительские цепи ДНК служат матрицами для синтеза новых, дочерних, цепей ДНК, так что новые двухцепочечные молекулы ДНК оказываются составленными из одной старой и одной новой цепи. При считывании в том же направлении (от 5'- к 3'-концу) последовательность нуклеотидов новосинтезированной цепи ДНК получается такой же, как в родительской матричной цепи, Синтез ДНК в направлении от 5'- к 3'-концу означает, что удлинение цепи происходит за счет присоединения дезоксинуклеозидтрифосфатов к свободной 3'-ОН-группе (с отщеплением пирофосфата). Сигггез ДНК происходит в направлении от 5'- к 3'-концу на ведущей цепи и в направлении от 3'- к 5'-концу иа отстающей цепи.
Если бы полимеризация ДНК происходила в направлении от 3'- 5', то растущий конец цепи заканчивался бы 5'-трифосфатом или в качестве предшественников должны были бы использоваться 3'-дезоксннуклеозидтрифосфаты. При утрате ДНК-полимеразой Гь сой (3'- 5')-экзонуклеазной активности должна уменьшиться скорость синтеза ДНК, но не его точность. Белки, связывающиеся с одноцепочечной ДНК в репликативной вилке, держат две цепи ДНК разделенными, закрывая собой основания и предотвращая тем самым их спаривание друг с другом.
У Ь'. сой репаративная система, исправляющая неправильное спаривание оснований и зависящая от их метилирования, может различать родительскую и дочернюю цепи ДНК, когда одна или обе цепи метнлированы, но не может этого делать, если обе цепи не метилированы. У Е со!~' и у вирусов, инфицирующих эукариотические клетки, новые циклы репликацин ДНК начинаются со специфического участка, часто содержащего несколько копий короткой последовательности, с которой связывается комплекс белков, участвующих в инициации процесса.
Для разрыва и сшивки заново цепей ДНК ферментом топоизомеразой 1 не нужен АТР, потому что энергия фосфодиэфирной связи временно накапливается в ковалентной связи фосфотирозина в активном центре фермента. В клетках дрожжей, мутантных по топоизомеразе 11, ДНК может реплицироваться, но хромосомы не могут разделяться в процессе митоза. à — Д И К Рве. 5-15. Фрагмент ДНК с одно- цепочечиым участком, образовав- шимся вследствие разрыва в ниж- ней цепи (задача 5-22).
5-22 Фрагмент ДНК, изображенный на рис. 5-15, является двухцепочечным на концах и одноцепочечным в середине. Для верхней цепи указана полярность. А. На каком конце фрагмента, 5' или 3', находится указанный на нижней цепи остаток фосфата (Р)? Б. Каким способом, по вашему мнению, будет заполняться с помощью репаративных внутриклеточных процессов разрыв в цепи ДНК? В.
Сколько фрагментов будет содержаться в нижней цепи (рис. 5-15), если разрыв в ней заполняется (в условиях реакции в пробирке) при наличии в среде только дезоксирибонуклеозидтрифосфатов и ДНК-полимеразы? 24 Глава б 5-23 Важный подход к изучению репликации ДНК вЂ” это применение электронной микроскопии, благодаря которой можно непосредственно наблюдать репликативную вилку, а на мелких молекулах ДНК можно видеть всю реплицирующуюся структуру.
Кроме того, при использовании специальных методов приготовления образцов можно отличать двухцепочечную ДНК от одноцепочечной. На рис. 5-16 изображен ряд пшотетических реплицируюгцихся молекул с участками одноцепочечной ДНК, показанными тонкими линиями. В одном раннем и очень важном электронно-микроскопическом исследовании реплнкации у бактериофага лямбда некоторые из этих структур были действительно обнаружены н встречались часто, а другие никогда не наблюдались. А.
Нарисуйте схематически репликационную структуру с двумя вилкамн, смещающимися в противоположных направлениях. Пометьте концы всех цепей (5' или 3') и укажите лидирующую и отстающую цепи в каждой репликативной вилке. Б. На основе своих знаний по рспликации ДНК укажите четыре структуры на рис. 5-16, которые наблюдались наиболее часто. Рис. 5-16. Гипотетические структу- ры реплицирующихся молекул (задача 5-23). Рис.
5-17. Искусственный субстрат для изучения процесса коррекции„ осуществляемого ДНК-полимера- зой 1 у Е. сой (залвча 5-24). Выделеннымн буквами обозначены нуклеотиды с радиоактивной мет- кой. Остатки, содержащие з' радиоактивную метку ~ос — — и' 5 '.... ТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТТ~ з .... А В отсутсгеие дезокситимидинтрнфосямте 1дттр! Б В яристтстеии Еттр ее 100 ВО .б н в о40 Ряс. 5-18. Коррекция ДНК-полимеразой 1 в отсутствие (А) н в при- 0 сутствии (Б) ЙТТР (залача 5-24).
Рвс тел ств ДН (спр тра был пере 1 2 3 4 Время, мни Время, мин 5-24 ДНК-полимераза 1 обладает кроме своей полимеразной активности еще и (3'- 5')-экзонуклеазной активностью. Эта активность проявляется во время коррекции для удаления неправильно спаренных оснований с конца новосинтезированной цепи ДНК. Чтобы определить эту активность, необходимо приготовить искусственный субстрат с одной ро1у(с1А)-цепью и одной ро1у(дТ)-цепью, который содержит на 3'-конце несколько остатков дТ, меченных "Р, за которыми следует несколько остатков г(С, меченных зН, как показано на рис.
5-17. Вы измеряете потерю меченых остатков с)Т и дС в отсутствие г(ТТР, когда синтез ДНК невозможен, и в присутствии г(ТТР, когда синтез ДНК может происходить. Соответствующие результаты представлены на рис. 5-!8. А. Для чего остатки Т и С пометили разными изотопами? Основные генетические механизмы 25 дит, а С-остатки отщепляются независимо от того, есть ли в реак- ционной смеси г)ТТР? Г. Можно ли ожидать изменения результатов, представленных на рис. 5-18, Б, если добавить дСТР и дТТР? Где образуется РНК-затравка, на специфических или на случайных участках матрицы? Идеальной матрицей при изучении этого вопроса может служить ДНК вируса М13, потому что она не содержит 3'-ОН-группы.
Для ответа на данный вопрос кольцевую ДНК этого вируса полностью копировали в присутствии ДНК-полимеразы бактериофага Т4, праймосомы Т4 (хомплекс геликазы и РНК-праймазы), различных ТАТР (рибонуклеозидтрифосфатов) и гПь)ТР (дезоксирибонуклеозидтрифосфатов). Затем двухцепочечные кольцевые продукты обрабатывали рестриктазой, которая расщепляет двойную цепь в специфическом участке. Продукты этого расщепления подвергали денатурации, после чего анализировали последовательность нуклеотидов ДНК методом гель-электрофореза с высоким разрешением. Было обнаружено много отдельных полос. Если продукты расщепления до электрофореза обрабатывали РНКазой, то все они становились на пять нуклеотидов короче, о чем свидетельствовала более быстрая миграция их в секвенирующем геле. Зная, что каждый продукт рестрикции заканчивается специфическим участком рестрикции, можно было по длине продукта установить матричную последовательность вблизи 5'-конца.
(Полная последовательность М13 известна.) Некоторые из этих матричных последовательностей показаны на рис. 5-19 слева. Последовательность ДНК на каждом нз соответствующих 5'-концов цепей продуктов была определена после удаления РНК-затравки. Эти последовательности показаны на рис. 5-19, справа, в той же строчке, что и комплементарная последовательность матричной ДНК.
Определите на основе этих данных стартовый участок для РНК-затравки на каждой матричной последовательности. Какой сигнал нужен для начала реакции, катализируемой РНК-праймазой? Ген ЫпаВ у Е. сей кодирует геликазу, которая участвует в расплетании ДНК на участке репликативной вилки. Свойства этого фермента были изучены с использованием искусственных суб- 5-26 Последовательности ДНК, связанные е РНК-затравкой 5' 3' Ааахт савах Асхат свтат тсххт Ававт тхттт тстха Сейт Мвтрнчные поепеловвгеяьноетн М!3 5' Атс тот 3' сттасаттахххт татттастссхах стсттатттастс тастхаттттхса авсхтастхаттт ттсстатттттаа тАтттасттАтАс аААсааттАссст Рис.
5-19. Матричные последовательности М13 (слева) и соответствующие последовательности ДНК, образуемые в каждом сайте (епрввв) во время синтеза РНК-затравки (задача 5-25). РНК-затравки были отделены от этих цепей ДНК перед секвепироваиием. Атт АСА Атт Атс ААА стх Б. Почему отщепление Т-остатков в отсутствие г(ТТР требует больше времени, чем отщеплеиие С-остатков? В. Почему в присутствии дТТР отщепления Т-остатков не происхо- 26 Глава б Область отаранных оснований 3 стратов, подобных тем, которые изображены на рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
