Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 7
Текст из файла (страница 7)
5-20. Экспериментальный подход заключался в том, что субстраты инкубировали в разных условиях и затем исследовали образцы методом электрофореза в агарозных гелях. Короткая одиночная цепь будет двигаться медленно, если она еще соединена с длинной цепью ДНК, и будет двигаться гораздо быстрее, если она расплетена и отделена от длинной цепи. Введя в короткую одиночную цепь радиоактивную метку, можно избирательно следить за ее миграцией, определяя ее положение в геле методом радиоавтографии. Результаты нескольких экспериментов показаны на рис.
5-21. Субстрат 1, представляющий собой гибридную ДНК без «хвостов», не расплегался с помощью бпаВ (рис. 5-21, дорожки 1 и 2). Однако когда инкубировали субстраты с «хвостами» при + 37'С в присутствии г!ПаВ и АТР, то за счет расплетания освобождалось значительное количество мелких фрагментов (дорожки 6 и !О). В случае субстрата 3 был раскручен только 3'-полуфрагмснт (дорожка 10). Процесс расплетания во всех случаях полностью зависел от гидролиза АТР. Расплетание существенно увеличивалось при добавлении белка, связывающегося с одноцепочечной ДНК, (ББВ-белок) (сравните дорожки 5 и б с 9 и !О). Интересно„что этот белок нужно было добавлять приблизительно через 3 мин после с(ггиВ, в противном случае он ингибировал расплетание.
А. Почему для расплетания нужен гидролиз АТР? Б. В каком направлении движется г(лаВ по длинной одноцепочечной ДНК? С чем больше согласуется это направление, с движением по ведущей цепи или по отстающей цепи в репликативной вилке? В. Почему белок, связывающийся с одноцепочечной ДНК (БЯВ), мог ингибировать расплетание, когда его добавляли до 41паВ, но стимулировал расплетание, когда его добавляли после а(паВ? Одноцепачечныд хвост, 3 "Н Рве. 5-20. Субстраты, использован- ные лля определения свойств дпаВ (задача 5-26). А — субстрат 1, Б' — суб- страт 2, В-субстрвт 3. Рв гав (зц Субстрат 1 Суу П 2 — — к — ъ бпаа + + — — + + Субатр З ззв + + После нагревания — — + вправление миграции Меченые фрагменты, свнаанные с немеченод ДН Рвс.
5-21. Результаты нескольких экспериментов по измерению расплетаняя с участием дпаВ (задача 5-26). Радиоактивная метка содержалась только в одаонепочечяых фрагментах, положение которых показано ва схеме. Свободные одноцепо мчные меченьм молекулы днк 3'.фрагмент б'фрагмент 1 2 3 4 б 8 7 8 9 10 11 12 5-27 В лаборатории, где вы работаете, занимаются изучением жизненного цикла вирусов животных. Геном у этих вирусов представлен Основные генетические механизмы 27 кольцевой двухцепочечной ДНК. Вам поручено определить положение точки(-ек) начала репликации и выясниггь в одну или в обе стороны от начальной точки протекает репликация (однонаправленный или двунаправленный синтез).
Чтобы достигнуть цели, вы выделяете реплнцирующиеся молекулы, расщепляете их ферментом рестрикции, который разрезает вирусный геном в определенном сайте (в результате чего из кольцевой молекулы образуется линейная молекула ДНК) и затем исследуете образующиеся молекулы с помощью электронной микроскопии. Некоторые молекулы, которые вы видите, схематически изображены на рис. 5-22. (Обратите внимание, что в электронном микроскопе невозможно отличить один копен молекулы ДНК от другого.) Вы должны представить свои выводы сотрудникам лаборатории на следующий день. Как вы ответите на вопросы, поставленные перед вами руководителем: 1) имеется ли здесь одна точка начала репликации или таких сайтов несколько; 2) в одном или в двух направлениях происходит репликацня? мама ме малекулм Глазки "Н "фа»ма Рне.
5-22. Исходная н репликапьваые формы вируса животных (задача 5-27). 5-28 Условно летальные мутации чрезвычайно полезны для генетического и биохимического анализа такого сложного процесса, как репликацня ДНК. Температурочувствительные (1з) мутации, являющиеся одной из форм условно летальных мутаций, позволяют организму расти при определенной температуре (например, 30 С), но препятствуют росгу при более высокой температуре (например, 42 'С). У Е. сой выделено большое число температурочувстаительных мутантов.
Все они дефектны по репликации ДНК при 42 С, но не при 30аС. Если температура среды повышается с 30 до 42'С, синтез ДНК прекращается» этих мутантов одним из двух характерных способов. У «быстро останавливающихся» мутантов синтез ДНК прекращается сразу же, а у «медленно останавливающихся» мутантов это происходит только спустя много минут. А. Попробуйте предсказать, мутациями в каких из нижеперечисленных белков, если онн температурочувствительные, будет обусловлен «быстро останавливающийся» фенотип, а в каких — «медленно останавливающийся». В каждом случае объясните ваше предсказание. 1.
ДНК-топоизомераза 1. 2. Инициаторный белок репликации. 3. Белок, дестабилизирующий спираль. 4. ДНК-геликаза. 5. ДНК-праймаза. 6. ДНК-лнгаза. Б. Характер репликации в бесклеточных экстрактах мутантов по существу не отличается от такового в ннтактных клетках. В экстрактах «быстро останавливающихся» мутантов при температуре 42 "С синтез ДНК прекращается сразу же, тогда как в случае «медленно останавливающихся» мутантов синтез ДНК продолжается в течение еще нескольких минут после повышения температуры до 42'С.
Предположим, что экстракты из мутанта, дефектного по температурочувствительной ДНК-геликазе, и из мутанта по температурочувствительной ДНК-лигазе были смешаны при 42'С. Какой фенотип будет показывать смесь: «быстро останавливающийся», «медленно останавливающийся» или немутантный? 28 Глава 5 Механизмы генетической рекомбинации (МБК 5.4) В Рв рек Ря< ЛВ 5-2 нос Бн кон 5-29 А Б В Г Д Б Ж 3 Заполните пропуски в следующих утверждениях.
При обмен генетическим материалом происходит между гомологичными последовательностями ДНК и наиболее часто между двумя копиями одной и той же хромосомы. В точке обмена цепь одной молекулы ДНК соединяется путем спаривания оснований с цепью второй молекулы ДНК, и между двумя двойными спиралями образуется Две одпоцепочечные комплементарные молекулы ДНК образуют целую двухцепочечную спираль в результате , которая начинается, по-видимому, с медленного этапа У Е.
сон необходим для спаривания хромосом: он связывается с одноцепочечным участком ДНК и способствует его спариванию с гомологичным участком в составе двойной спирали ДНК. Сразу же после возникновения синапса образовавшаяся короткая гетеродуплексная область, где начали спариваться цепи двух разных молекул ДНК, увеличивается за счет Центральным промежуточным этапом в процессе общей рекомбинации является с образованием интермедиата, который называют в честь его первооткрывателя. Во время рекомбинации между двумя слепса различающимися копиями одного гена (аллелями) один аллель может замешаться другим в процессе, называемом Подвижные последовательности ДНК и некоторые вирусы внедряются в хромосомы-мишени и выходят из них с помошью системы генетической рекомбинации. Укажите, какие из следующих утверждений правильные, а какие— нет.
Если утверждение неверно, объясните почему. Общая рекомбинация происходит в том случае, когда имеются протяженные участки с гомологичными последовательностями в спиралях обоих партнеров, а для сайт-специфической рекомбинации требуются лишь короткие специфические нуклеотидные последовательности ДНК, которые иногда могут присутствовать только у одного из обменивающихся партнеров.
Общая рекомбинация заключается в физическом обмене сегментами ДНК, который связан с разрывом и последующим восстановлением фосфодиэфирных связей в молекулярном остове ДНК. Белок гесА сочетает способность к сайт-специфическому разрезанию одноцепочечных ДНК с АТР-зависимой ДНК-геликазной активностью, которая обеспечивает расплетание одноцепочечных «усов» в дуплексной молекуле ДНК.
Белок Е. сод, связываюшийся с одноцепочечной ДНК, (эБВ-белок) распрямляет короткие, в вцле шпилек, спирали в одноцепочечных участках ДНК путем присоединения к их сахарофосфатному остову; в результате этого все основания оказываются «открытыми». Белок гесА связывается одновременно с одноцепочечной ДНК и с двухцепочечной ДНК, катализируя образование синапса между ними. В обмене участками между цепями участвуют две различающиеся пары цепей: перекрещенные и неперекрещенные; для превращения их из одного состояния в другое необходимо, чтобы фосфодиэфирная связь была разорвана хотя бы в одной цепи.
У грибов за счет процесса конверсии генов иногда происходит изменение пола; в результате спаривания обычно образуется рав- Основные генетические механизмы 29 нос число мужских и женских спор, но иногда нх соотношение равно 1:3 или 3: !. 3. Все известные механизмы конверсии генов связаны с ограниченным синтезом ДНК. . И. Включение генома фага лямбда в геном Е. со?т' катализируется сайт-спецнфнческой топонзомеразой (называемой лямбда-ннтегразой), узнающей короткие специфические последовательности ДНК в обеих хромосомах.
5-3! Пользуясь рис. 5-23,А, изобразите продукты перекрестной рекомбинации между гомологичнымн участками молекул, изображенных на рис. 5-23,Б. На этом рисунке ДНК-дуплекс изображен тонкой линией, а мишени для гомологнчной рекомбинации — стрелками. 5-32 Специфические последовательности ДНК, известные как Хи-сайты, локально стимулируют гомологичную рекомбинацию у Е. сой, происходящую с участием гесВСО. По-видимому, в результате взаимодействия между белком гесВС)3 и Хн-сайтом стимулируется этап, лимитирующий скорость рекомбинации.
Чтобы детально изучить это взаимодействие, белок гесВС(3 был очищен н проннкубнрован с линейными двухцепочечнымн фрагментамн ДНК, содержащими Хн-сайз (рнс. 5-24). Различные фрагменты линейной ДНК сначала специфически метили на 5'-конце слева (5'Ь) н на 5'-конце справа (5'К), а также на 3'-конце слева (3'Ь) и на 3'-конце справа (3'В). Затем препарат каждого фрагмента инкубнровалн в буфере, содержащем гесВСЫ- белок. В качестве контроля отдельную пробу меченой ДНК инкубнровали в буфере без гесВС)3. Инкубация длилась 1 ч, После этого ДНК денатурировали кипячением и образовавшиеся одиночные цепи разделяли с помощью электрофореза в полиакриламндном геле. Распределение радиоактивно меченных фрагментов ДНК показано на рнс.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
