Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 5
Текст из файла (страница 5)
5-9. БОБ-ответ у Ь: спл (звдвча 5-15). Неиндуцированные гены Ганы,индуцируемые поврежГцгнием (ОецкйвкВжмйы":л Репрессия lехд (Ощгг8(5 ц5 ц5л:::ц (Оахййвнцыжнн:::~ Репрессия г Низкан Репрессия г Низкая основная основная скорость ~ скорость ф ~ехд ф гесА активируетсн вязывании с оцДНК, д действием агентов, р д хДНК Активироваиный гесА цу каиров изводит щеппени Ф ~©р© гесА Синтез сильно дерепрессироеаи ЗОЗ.ответ (Э !ехА ~ Э Расцыппенный МхЯ неактивен Зкспресснруемые гены Гены,индуцироеанные повреждением гехд Индуцированные гены Путь, подверженный ошибкам, связан, по-видимому, с неправильным включением нуклеотидов против участка с неисправленным повреждением. При необходимости ДНК-полимеразы включают против участка с неясными кодирующими свойствами, например против пнримидиновых димеров, адениловые нуклеотиды.
Представляет ли собой это так называемое «правило Ан хорошую стратегию для борьбы с УФ-повреждениями ДНК? Рассчитайте частоту изменений в основаниях (мутации) при действии этого правила и прн случайном включении (каждый нуклеотид с равной вероятностью) для Е. со((„у которой пиримидиновыми димерами являются приблизительно 60% ТТ, 30% ТС и СТ и 10% СС. Основные генетические механизмы 59 Рне. 5-10. Раснрелелонне ннлулнрованных ультрафиолетовым излучением мучацнй в гене 1ас1 у Е.
соп (задача 5-16). 0 о а Й 5 о о м 10 300 100 Полажение иуилеогиве в гене лепно возрастает при 505-ответе. Если целью последнего является максимальная экспрессия генов, индуцируемых при повреждении ДНК, то как может находи~ься при этом на высоком уровне и экспрессия репрессора? Другими словами„почему!ехА нс экспрессируется все время с низкой скоростью? Видите ли вы какое- нибудь преимущество в том, что для регуляции БОВ-ответа требуется экспрессия !ехА? 5-16 Варианты индуцированных ультрафиолетом мутаций в гене !ас! у Е. сой были подвергнуты т1цательному изучению.
На рис. 5-10 сверху от линии нуля показано общее число выделенных независимо миссенс-мутаций (несинонимичных замен кодонов аминокислот), а под линией нуля число мутаций со сдвигом рамки (изменение рамки считывании). Количество мутаций обеих категорий почти одинаково. Миссенс-мутации были идентифицированы по критерию утраты функции белка, кодируемого геном ?ас( (!ас-репрессор); мутации со сдвиз.ом рамки были выявлены с помощью метода слияния генов, которое не зависит от функционирования !ас-репрессора.
А. Как вы считаете, в чем причина того, что на концах гена миссенсмутаций возникает гораздо больше, чем в его середине? Почему мутации со сдвигом рамки распределены по гену более или менее равномерно (за исключением одного или двух «горячих мест»)? Б. Анализ последовательности в одном «горячем месте» ДНК (с пометкой 1 на рис. 5-10) показал, что у дикого типа зто было ТТТТТС, а у мутанта — ТТТТС.
Другая наиболее частая мутация (с пометкой 11 на рис. 5-10) заключается в изменении от ОТТТТС к ОТТТС. Анализ других мутаций со сдвигом рамки показал, что большинство их связано с потерей одного основания; никаких вставок обнаружено не было. Можете ли вы высказать предположение о молекулярном механизме потери одной пары оснований исходя из того, что вам известно о природе УФ-повреждений ДНК? 5-17 Кроме эндонуклеазной репарации пугАВС, рекомбинантной репарации и ЗОБ-репарации у бактерий есть еще более мощная система репарации, предназначенная для ликвидации пиримидиновых димеров (данная система здесь не рассматривается). Этот механизм был открыт в процессе поиска некоего неконтроли- 20 Глава б руемого фактора,шрающего роль в действии ультрафиолетового света на бактерии. История открытия похожа на сюжет, описанный ниже.
Представьте, что вы параллельно со своим руководителем пытаетесь выделить мутанты Е. со10 используя ультрафиолетовое облучение в качестве мутагенного воздействия. Для того чтобы получить много различных мутантов, вы применяете такую дозу облучения, от которой гибнет 99,99;4 бактерий. Полученные вами результаты гораздо более однозначны, чем те, что получил ваш руководитель, использовавший в 10 и 100 раз более высокие дозы облучения, чтобы достичь такого же уровня гибели бактерий.
Руководитель сомневается в ваших результатах из-за того, что вы всегда ставите опьпы ночью, после его ухода. Когда по настоянию руководителя вы приходите утром и ставите свои опыты параллельно с ним, у вас обоих неожиданно получаются совершенно одинаковые результаты. Вы немного огорчены, потому что полученные данные ближе к результатам вашего руководителя, а ведь вы самоуверенно полагали, что в экспериментальной работе более искусны, чем ваш наставник, которого к тому же редко видели в лабораторном халате в последнее время. Однако когда вы вместе повторяете эксперименты ночью, то, к удивлению руководителя, результаты оказываются точно такими, как те, что вы получили раньше.
Теперь, когда утвердилось доверие к результатам друг друга, быстро появляется ясность. Оказывается, для достижения одного и того же уровня летального повреждения бактерий в дневное время (в полдень) нужна более высокая доза ультрафиолетового света, чем утром. В солнечные дни требуются более высокие дозы, чем в пасмурные. Окна лаборатории выходят на запад. Попробуйте ответить, какой переменный фактор вносил неясность в ваши эксперименты? 5-18 Такие мутагены, как Х-метил-Х'-нитро-Х-ннтрозогуанидин (МННГ) н метнлнитрозомочевина (МНМ), являются мощными метилирующими ДНК агентами.
Они чрезвычайно токсичны для клеток. Нитрозогуанидины применяются в исследовательской работе в качестве мутагенов, а в клинической практике — как лекарственные средства при химиотерапии рака, поскольку в первую очередь они вызывают гибель клеток, находящихся на стадии репликации. Оригинальный эксперимент, который привел к открытию алкилирующей системы репарации у бактерий, был задуман так, чтобы определить долговременный эффект применения низких доз МННГ (как при химиотерапии) в сопоставлении с эффектом временного воздействия высоких доз МННГ (примеияемых для мутагенеза). Бактерии помещали сначала в среду с низкой концентрацией МННГ (1 мкг?мл) на 1,5 ч, а затем переводили в свежую среду без МННГ.
В разные моменты инкубации при низкой концентрации МННГ и после нее пробы из суспензии бактерий подвергали воздействию МННГ в высокой концентрации (100 мкг/мл) в течение 5 мин, а затем проверяли на жизнеспособность и частоту мутаций, На рис. 5-11 хорошо видно, что во время инкубации в среде с низкой концентрацией МННГ количество выживших клеток временно увеличивалось и частота мутаций у выживших бактерий уменьшалась. Как показано на рис.
5-12, этой приспособительной реакции на низкие дозы МННГ не наблюдалось, если в инкубационную среду был добавлен хлорамфеникол (ингибитор синтеза белка). 1 с Ъ в с 0 м (1 к~ ч: 8 й' 81 Р 21 Рв ла ни (за ба~ до (1 ба. це~ лез ген Рв~ раз иы: вы: обг в в 5-1! мех яео вая нов ных 120 ао х е 40 йх 30 .„'* Зу 2О 10 й 30 аа 0 60 а я 40 20 00 с 40 ае ао аФ 20 аа Вй 1О х 0 яо яо ао ео Ичхгааалл а МННГ, млл Рнс.
5-12. Действие хлорамфеннко- ла на адаптационный ответ при низких дозах мутагена МННГ (задача 5-!8). После инкубации бактерий в течение разных перио- дов времени в присутствии МННГ (! мкг/мл) отбирали пробы и обра- батывали нх мутагеном в кон- центрации 100 мго/мл для опре- деления чувствительности к мута- гену. а 40 У$ 3О й ех 20 ч;г и 0 Начало 1О Вааегаллиа, ем Рнс. 5-11. Адаптационный ответ Е.
сой на низкие дозы мутагена МННГ (задача 5-!8). Мутаген в концентрации ! мкг/мл присут- ствовал в среде в период от — 1,5 до 0 ч. Пробы отбирали в различные моменты инкубации н кратковре- менно обрабатывали их мутагеном в высокой концентрации (!00 мкг/мл), после чего оценивали количество вьскившнх клеток и частоту образования мутантов. Рнс. 5-13. Хроматографическое разделение меченых метилированных пуринов из ДНК необработанных бактерий и из ДНК бактерий, обработанных мутагеном МННГ в низкой концентрации, (задача 5-!9). Сплопгная линия — спектр метнлированных пуринов нз ДНК необработанных бактерий; 1втриховая †спек метилироваииых пуринов из ДНК бактерий, обработанных мутагеном.
Основные генетические механизмы 21 о 0 -2 -1 0 1 2 3 4 Время, ч А. Связана ли приспособительная реакция Е. сой на низкие уровни МННГ с активацией уже существующего белка или для нее необходим синтез нового белка? Б. Как вы полагаете, почему приспособительная реакция Е. со/1 на низкую дозу МННГ является кратковременной? 5-19 Природа мутаций, вызываемых МННГ, а также механизм их удаления из ДНК были определены в следующих экспериментах.
Чтобы выяснить характер мутагенного повреждения, интактные, а также обработанные низкими дозами МННГ бактерии инкубировали 10 мин в среде, содержащей меченый мутаген — зН- МННГ,— в концентрации 50 мкг/мл. Затем из бактерий выделяли ДНК, гидролизовали ее до нуклеотидов и определяли радиоактивные пурины с помощью хроматографии на бумаге, как показано на рнс.
5-13. Чтобы выяснить механизм ликвидации мутагенного повреждения, был сначала выделен и очищен фермент, ответственный за удаление места повреждения. Кинетику репарации изучали путем инкубации различных количеств фермента (мол. масса 19000) с ДНК, содержащей 0,26 пмоль мутагенного основания, меченного тритием. В разные моменты инкубации отбирали пробы и анализировали в них ДНК на остаточное содержание мутагенного основания (рис. 5-14). Когда опыт повторили при 5'С вместо 37 "С, начальные скорости репарации были более низкими, а конечные теми же самыми. А.
Какой метилированный пурин ответствен за мутагенное действие МННГ? 22 Глава б Ь, В чем состоит особенность кинетики удаления метильной группы из мутагенного основания? Связана ли эта особенность с нестабильностью фермента? В. Рассчитайте число метильных трупп, удаляемых каждой молекулой фермента. Поможет ли этот расчет объяснить особенность кинетики'? 100 ж я о $7в о Во к я 2в о Механизмы ренликации ДНК (МБК 5.3) 5-20 Заполните пропуски в следующих утверждениях А. Фермент, ответственный за синтез ДНК как при репликацни, 1ак и при репарации, называется Ь. Активный участок хромосомы, участвующий в репликации, представляет собой х'-образную структуру, называемую В.
У Е. сол новосинтезированная ДНК кратковременно обнаруживается в молекулах длиной 1000-2000 нуклеотидов, называемых 2 4 В Время, мне Рис. 5-14. Удаление меченных три- гием метильиых групп из ДНК с помощью очищенного фермента метилграисферазы (за?1ача 5-19). Количество очищенного фермента указано иад каждой кривой. Г. Фермент, который сшивает разрывы в ДНК во время синтеза ДН К или ее репарации, называется Д.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
