Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 12
Текст из файла (страница 12)
5-30. Окончательная структура гибридного гена (задача 5-50). Ваг»Н! Вашн! 1 — аоо — ! зсо 1 зоо 1 700 Есои! Есои! м 4 >ь >и е» па ть ,ку ;ся >го ые енюй >ин об- ься ана нет ши- рас- обчто кон- ный з,о гпо я,о >,з >000 жи тоо 500 О,о >,о 0,0 О,а при о,а Рас. 5-40. Сшивание фрагментов очищенной ДНК (А) и диагностическое расщепление очищенного фрапнента длиной !,3 т.п.н.(Б) (задача 5-50). азой отке О,Ф Вап>Н! рекомбинантной плазмидной ДНК. Один фрагмент содержит 400 п.
н., другой — 900 п.н. Вы хотите объединить их вместе, как показано на рис. 5-39, чтобы создать гибридный ген, который в том случае, если ваши ожидания правильны, будет иметь новые удивительные свойства, Вы смешиваете два фрагмента в присутствии ДНК-лигазы и инкубируете смесь. Через 30 мин после начала инкубации и второй раз через 8 ч вы отбираете пробы и анализируете их методом электрофореза в геле. Вас удивляет, что вместо ожидаемой рекомбинантной молекулы размером 1,3 т.п.н. электрофореграмма содержит сложный набор фрагментов (рис.
5-40, А). Вы замечаете, что при более длительной инкубации интенсивность полос, соответствующих более мелким фрагментам, уменьшается, а интенсивность полос, соответствующих более крупным фрагментам, увеличивается. Если вы добавляете к смеси сшнваемых молекул ВагпН1, то вновь образуются исходные фрагменты '(рис. 5-40, А), Находясь в недоумении, но настойчиво продолжая исследование, вы проводите очистку фрагмента размером 1,3 т.п.н. с помощью гель-электрофореза, контролируя структуру путем обработки пробы рестриктазой ВшпН1. Как вы и ожидали, при этом заново появляются две исходные полосы (рис. 5-40,Б).
Чтобы убелиться все-таки, что это именно та структура, которую вы хотели получить, вы обрабатываете другую пробу рестриктазой ЕсоК1. Вы ожидали, что при этом получатся два фрагмента длиной 300 нуклео>ннов и один фрагмент размером 700 нуклеотидов. И снова вы удивлены сложностью набора полос в геле (рис. 5-40, Б). А. Почему исходная смесь соединяющихся фрагментов ДНК дает так много полос в геле? Б. Почему при обработке очищенного фрагмента длиной 1,3 т.п, н.
рестриктазой ЕсоК1 образуется так много фрагментов? 44 Глава 5 Евон! вввн~ 4 4тл.ю — -ь 1 Рве. 5.4 ДНК и (задача 5-51 Вектор Рве. 5-41. Рекомбинантная плаз- мида, содержащая клонированнмй сегмент ДМК (задача 5-51). з,т Полночь. Вас разбудил коллега, чтобы поделиться еще одним грандиозным проектом.
Он потратил два последних года на очистку белка, прелставляющсго собой сильный молулятор иммунного ответа. Вечером он получил первые 30 аминокислот на аминокислотиом анализаторе (рис. 5-43). Ему нужен ваш совет, как лучше клонировать ген, чтобы добиться высокого уровня его экспрессии в бактериях. Он доказывает, что этот белок, благодаря стимулированию имунной системы, мог бы служить отличным средством лля лечения простуды. Он и название ему уже подобрал — иммустим. Хотя ко.'тлега и увлекающийся человек, но он ваш друг, поэтому вы откликаетесь на его ипею, пообещав позвонить через 15 мин, как только переведете аминокислотную последовательность в нуклеотидную. Какие два набора олигонуклеотидов размером по 20 нуклеотидов вы порекомендуете другу-коллеге в качестве наилучших зондов гибрилизации лля скрининга библиотеки геномной ДНК? 1,4 4,'З 0,7 о,я Рнс.
5 42. Радноавгограмма, пока- зывающая электрофоретическое разделение меченых фрагментов после частичного расщепления тремя рсстриктазами, обозначен- ными разными символами (задача 5-51). Числа слева указывают раз- меры маркерных фрагментов (в т. и. н.). На основе своей предыдущей работы вы предполагаете, что глутамин (О) в сегменте белка, изображенном на рис.
5-44, играет важную роль в активном центре. Ваш руководитель хочет, чтобы вы изменили белок тремя путями: заменили глутамин на лизин 5-53 Рве. 5 43. Первые 30 аминокислот, определенные вашим коллегой с помощью аминокислотного анализатора (задача 5-52). Рве. 5-45. ксисеквен за клони1 5-54). 10 20 30 Мс'хИМ10П5Т Е1ЗИИРЬхМКЭ ГЗЕАКНЯЬ1СЕ Вы провели клонирование сегмента (4000 п.н.) интересующего вас гена в плазмидном векторе (рис.
5-41) и теперь хотите получить карту рестрикции этого гена, чтобы перейти затем к другим манипуляциям с ДНК. Ваш руководитель оставил вам инструкции относительно того, как все это нужно сделать, и отправился в отпуск, так что иы можете полагаться только на себя. Вы следуете его инструкциям, перечисленным ниже. 1. Разрезать плазмиду рестриктазой Есойй 2. Добавить к концам, образовавшимся после обработки ЕсоВ1, ралиоактивную метку. 3. Разрезать меченую ДНК рестриктазой ВашН1.
4. Очистить встроенную ДНК от плазмиды. 5. Обработать меченую ДНК-вставку рестриктазой в течение короткого периода времени так. чтобы кажлая меченая молекула была разрезана в среднем один раз. 6. Повторить этап 5, используя разные рестриктазы. 7. Провести электрофорез частично расщепленных ДНК в агарозном геле„ причем препараты, обработанные разными рестриктазами, нанести на гель рядом друг с другом. 8.
Наложить гель на рентгеновскую пленку, чтобы получился радиоавтограф фрагментов с радиоактивным концом. 9. Нарисовать рестрикционную карту. Наиболее трудным для вас был этап 5, олнако, уменьшая количество фермента и снижая температуру, вам удалось подобрать условия для частичного расп1епления. Затем вы смогли полносгъю выполнить этап 8 и получить радиоавтограмму, представленную на рис.
5-42. К сожалению, руководитель не объяснил вам достаточно подробно, как строить карту по данным радиоавтограммы. Он должен всрнуться завтра. Хватит ли вам времени, чтобы нарисовать ее? Основные генетические механизмы 46 Рис. 5-44. Послсдовательиости ДИК и кодируемого ею белка (задача 5.53) и О Р (3 О 6 ч 1 5' — СТТАОАОАСССОСАОООСООСОТСАТС вЂ” 3' (К), заменили глутамин на глицин (ьт) и просто удалили глутамин нз белка. Вы планируете произвести эти мутационные изменения путем гибридизации соответствующего олигонуклеотида с ДНК вируса М13. Когда олигонуклеотид расположится вдоль кольцевой молекулы М13, с участием ДНК-полимеразы будет достроена полная цепь, кодирующая комплемент желаемого мутант; ного белка.
В качестве первого шага в осуществлении мутационных изменений предложите три олигонуклеотида размером 20 нуклеотидов, которые могли бы гибридизоваться с клонируемым геном на одноцепочечной ДНК вируса М13. 4™ Ф «ии Рис, 5-45. Использование дилезо- ксисехвеиирующего геля лля анали- за хлонированпой ДНК (задача 5-54). 5-54 Наглядный пример использования дидезоксисеквенирующег о геля показан на рис. 5-45. Попытайтесь разобраться в нем. Если чтение геля начать снизу вверх, то последовательность будет соответствовать мРНК для белка. Можете ли вы обнаружить открытую рамку считывания в этой последовательности? Плазматическая мембрана Липидный биелой (МБК 6.1) И К Л б-1 А Б В Г д Е Ж 3 Заполните пропуски в следующих утверждениях.
Молекулы липидов в биологических мембранах образуют непрерывный двойной слой толщиной 5 нм, называемый В мембранах клеток присутствуют три основных типа липидов, а именно и Все мембранные липиды-, поскольку один конец их молекул пщрофильный, а другой — гидрофобный. Гидрофильный конец молекулы фосфолнпида состоит из головы, а гидрофобная часть состоит из двух хвостов. При помещении амфипатических молекул в водную среду они агрегируют таким образом, что их гидрофильные концы контактируют с водой, а гидрофобные спрятаны внутри. В результате этого возникают структуры двух типов: сферические или плоские . В обеих сгруктурах гидрофобные хвосты размещаются между слоями гидрофильных головок.
Искусственные бислои, содержащие определенные липиды или смесь разных лнпидов, можно получить либо в форме сферических везикул, называемых , либо в форме плоских бислоев, называемых мембранами. Метод электронного парамагнитного резонанса, который очень полезен для изучения подвижности молекул липидов, требует введения в липиды , например, нитроксильного радикала. При определенной (характеристической) температуре искусственные бислои липидов, получаемые на основе какого-либо одного типа фосфолипида, переходят из жидкого в твердокристаллическое состояние (или наоборот); такое изменение состояния называется Липиды, содержащие олигосахариды и называемые присутствуют только в наружной половине бислоя. Их углеводные группы зкспонированы на поверхности клетки.
Гликолипид — основной нейтральный гликолипид мно- гослойной мембранной оболочки, окружающей аксон нервной клетки, ( оболочка) — может играть важную роль во взаимодействии аксона с клеткой, влияя на обертывание мембраны вокруг аксона. Гликолипиды, имеющие в своем составе опаловую кислоту, на- зываются .
Один из таких гликолипипов— связывающий холерный токсин. Плааматическал мембрана 41 Укажите, какие из следующих утверждений правильные, а какие— нег. Если утверждение неверно, обьясните почему. Липидный бислой — основной структурный компонент всех клеточных мембран. Для сохранения лнпидного бислоя в плазматической мембране необходимо действие специальных ферментов и гидролиз АТР. Молекулы липидов свободно диффундируют в плоскости бислоя, но не могут преодолеть его в поперечном направлении путем мгновенного перескока молекулы с одной стороны бислоя на другую (транслокация, или «флип-флопв), если в мембране нет особых ферментов, известных под названием транслокаторов фосфолипидов. Температура, при которой мембрана эукариотических клеток «замерзает», прямо зависит от количества содержащегося в мембране холестерола.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
