Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 13
Текст из файла (страница 13)
Изменения формы мембран, обусловленные значительным сжатием или растяжением обеих сторон лнпидного бислоя, возможны благодаря высокому содержанию холестерола, так как в отличие от фосфолипидов холестерол может легко перемещаться из одного монослоя в другой при таких воздействиях. Генетически измененные эукариотические клетки, потерявшие способность к синтезу холестерола, подвергаются лизису при добавлении холестерола в культуральную среду.
Головы фосфолипндов на внешней поверхности клетки несут чистый положительный заряд, потому что холиновые группы голов фосфатидилхолина-(СНз)зХ'СН,СНзОН вЂ” размещаются преимущественно в наружном монослое. Та поверхность мембраны эритропита, которая обращена внутрь клетки, заряжена отрицательно, потому что в этой половине бислоя имеется относительный избыток фосфатидилсерина. В живых клетках гликолнпиды никогда не выявляются на той поверхности мембраны, которая обращена к цитоплазме.
Ре~уляция поступления питательных веществ в клетку — основная функция плазматической мембраны. Эта функция особенно отчетливо проявляется у эпителиальных клеток, выстилающих кишечник, поскольку через них проходит весь поток питательных веществ, поступающих в организм. В соответствии с этим их плазматическая мембрана устроена так, что на той стороне клеток, которая обращена в полость кишечника, она уложена в виде многочисленных пальцевидных выростов, называемых микроворсинками. За счет этого поверхность эпителиальных клеток многократно возрастает, что способствует более эффективному поглощению питательных веществ. На рис.
6-1 микроворсинки изображены в профиль и в поперечном разрезе. По представленным на этом рисунке масштабам попытайтесь оценить, насколько увеличивается поверхность клетки (обращенная в полость кишечника) за счет дополнительной поверхности микроворсннок по сравнению с поверхностью клетки, покрытой плоской плазматической мембраной. Представьте себе, что ваш товарищ только что вернулся нз путешествия по Африке. При переправе через реку Лимпопо его укусила ядовитая водяная змея, и он чуть не умер от интенсивно~о гемолиза.
Как истинный биолог, ваш товарищ, до того как потерял сознание, поймал эту змею и теперь попросил вас проанализировать ее яд, чтобы установить природу его гемолнтической 48 Глава б Рис. 6-1. Микроворсинки зннте- лиальных клеток кишечника (вил сбоку и поперечный срез) (залача 6-3). (С разрешения л-ра Ито и л-ра Ишнкава.) 1 мкм 0,1 мкм активности. Вы обнаруживаете, что в яде присутствуют протеаза (разрывающая пептидные связи в белках), нейрамннидаза (отщепляющая остатки сиаловой кислоты от ганглнозидов) и фосфолипаза (расщепляющая фосфолипнды). В результате обработки изолированных эритроцитов этими очищенными ферментами были получены данные, приведенные в табл.
6-1. Анализ продуктов гемолиза, вызываемого фосфолипазой, показал необычно высокое содержание в них свободного фосфорилхолнна (холнна, соединенного с остатком фосфорной кислоты) и диацнлглицерола (глицерола, соединенного с двумя цепями жирных кислот). А.
Что служит субстратом для фосфолипазы, в каком участке молекулы субстрат расщепляется? Б. На основании ваших знаний о структуре плазматической мембраны объясните, почему фосфолипаза вызывает лизис эрнтроцитов, а протеаза и нейраминидаза — нет. Предположим, что вас интересует распределение различных фосфолнпидов в плазматической мембране эритроцитов человека. Прежде всего на долю фосфолипидов в бислое эритроцнтов приходится 60% массы всех липндов, тогда как доля холестерола составляет 30%, а гликолипидов — 10%. Фосфолипиды включают: фосфатидилхолин (28%), фосфатидилэтаноламин (27%), сфингомиелин (26%), фосфатидилсерин (13%) и некоторые другие, минорные, фосфолнпнды (несколько процентов). Чтобы выявить распределение этих фосфолипидов, целые эритроциты н их тени обрабатывают: 1) двумя различными фосфолипазами и 2) не проникающим через мембрану флуорохромом ($1ТБ), который, связываясь химически с первичными аминогруппами, специфически метит нх.
Под действием сфингомнелиназы разрушается до 85% сфинго- Таблииа 6-1. Результаты обработки эритронитов ферментами, выделенными нз змеиного яла (залача 6-4) Рв ни ме ло Вв ра, пр фо Очищенный фермент Гемолиз Протеаза Нейрамннилаза Фосфолилаза Нет Нет Да 4-1 Плазматическал мембрана 49 мнелнпа в случае эритроцитов (лизиса клеток при этом не происходит) и немного больше в случае теней эритроцитов.
После обработки ннтактных эритроцнтов смесью фосфолнпаз из яда морских змей в среду выходят продукты расщепления фосфатидилхолина (лизиса клеток не происходит), а при обработке теней эритропитов эти же фосфолнпазы вызывают, кроме того, разрушение фосфатидилсерина и фосфатидилэтаноламина. Реагент 'э1ТЯ метит почти полностью фосфатндилэтаноламин и фосфатндилсернн в тенях эритроцитов н лишь около 1% этих соединений в целых клетках. А. Результаты этих опытов представлены в табл. 6-2. Они позволяют судить о распределении четырех основных фосфолипидов в мембранах эритроцитов. Какие фосфолипиды сосредоточены в обоих монослоях этих мембран и есть ли такие? Б. Почему в этих опытах использовали эритроциты? Таблица 6-2.
Чувствительность фосфолапндоа в составе зрптроццгоа человека л в составе теней этих клеток к фосфолапазам и к метке $1ТЬ, пс проникающей через мембрану (задача 6-5) н н Фосфолапцд Сфаагомаелаааза Яд морских змей Флуоресцсццаа Я1ТЯ Эратро- Тени Эратро- Тени Эрвтро- Теаа цвты цаты паты Ннчрпкснпьный радикал геаза щепгпаза згро- юлу- Фосфатадллхолаа Фосфатадилэтааоламин Сфвпгомвелап Фосфагидалссрин азал лина пил- еных Свин. меченный Епсфплипид 3 юле- аем- оци- фосюка. ггов юла пот: нго- мисить геди тро- свя- хки Спин-меченный фосфппипид 2 Рдс. 6-2. Схематическое азображеаас двух одинаковых лапндов, меченных аптроксальным радикалом в различных положениях.
Вверху изображен нлтроксальаый радикал, ниже показаны места его лрлсосдлнсапд к молекуле фосфолаппда (задача 6-6). е 1еж 6-6 За поведением лнпидов в двух монослоях мембраны можно проследить, введя в отдельные молекулы в качестве метки нитроксильную группу, являющуюся стабильным органическим свободным радикалом (рнс. 6-2). Такие спин-меченые липиды можно изучать методом электронного парамагннтного спинового резонанса (ЭПР) непосредственно в живых клетках. Перед тем как ввести спин-меченые липиды в мембраны клеток, смесь меченых и немеченых фосфолнпидов обрабатывают ультразвуком с целью получения маленьких липидных везикул.
При добавлении последних к суспензии целых клеток в определенных условиях везикулы сливаются с клетками, перенося меченые лиганды в их плазматическую мембрану. На рис. 6-2 схематически изображены молекулы фосфолипида, содержащие спиновую метку в двух разных положениях. Такие меченые фосфолипиды вводили в мембраны эритроцитов описанным выше методом. Для того чтобы выяснить, одинаково лн встраиваются меченые фосфолипиды в два монослоя бислойной мембраны, в среду добавляли аскорбиновую кислоту (витамин С). Будучи восстановителем, растворимым в воде, этот реагент не проникает сквозь мембрану и разрушает все нитроксильные радикалы на внешней поверхности клетки.
На рис. 6-3 представлена зависимость сигнала ЭПР от продолжительности инкубации клеток с двумя различными метками в присутствии витамина С и без него. 60 Глава 6 Я Фосфопипид! 6 Фосфопипид 2 ее 100 Е й б 76 Ь п 60 26 ж "1 100 Е й 76 6 $60 $ 26 10 20 Время, мии 30 \ 2 время, ч Рве. 6-3. Уменьшение интенсив- ности сигнала ЭПР в зависимости ог длительности инкубации эритро- цитов с меченым фосфолипидом 1 (А) и фосфолипидом 2 (Б) в присутствии аскорбата и без него (задача 6-6). Не учитывая пока различий в степени уменьшения сигнала ЭПР, попытайтесь объяснить, почему фосфолипид 1 (рис.
6-3, А) взаимодействует с аскорбиновой кислотой быстрее, чем фосфолнпид 2 (рис. 6-3, Б). Заметьте, что область плато в случае фосфолипида 1 достигается за 15 мнн, а в случае фосфолипида 2 — гораздо медленнее, за ! ч. Для выяснения причин того, почему эти фосфолипиды различаются по скорости и величине уменьшения сигнала ЭПР, были проведены аналогичные опыты с тенями эритроцитов, обработанными так, что они были непроницаемы для аскорбата (нз-за замыкании мембраны). В этих опытах в отсутствие аскорбата не наблюдалось снижения величины сигнала ЭПР для обоих фосфолипндов, а при добавлении аскорбата сигнал устанавливался на уровне 50%.
Попробуйте объяснить, чем обусловлены различия в изменениях сигнала ЭПР в опытах с тенями эритропитов и с целыми эритроцитами (см. рис, 6-3). Одинаково ли встраивались спин-меченые фосфолипнды 1 и 2 в оба монослоя мембраны эритроцитов? В. Асимметрическое распределение фосфолипидов по двум моно- слоям плазматической мембраны указывает на то, что спонтанный перескок липида с одной стороны мембраны на другую — редкое событие, хотя, возможно, любой спонтанный перескок быстро компенсируется соответствующими переносчиками фосфолипидов, возвращающими их на прежнее место в монослое.
Для того чтобы определить, какая из этих двух возможностей реализуется, была измерена скорость перескока фосфолипндов в плазматической мембране интактных эритроцнтов. В одном из экспериментов использовали те же два фосфолнпида со спин-метками, о которых шла речь в задаче 6-6 (рис. 6-2). С целью измерения скорости транслокации от внутреннего монослоя к наружному эритроциты со свин-мечеными фосфолипидами, сосредоточенными только во внутреннем монослое плазматической мембраны, инкубировали в течение различных периодов времени в присутствии аскорбата и следили за изменением интенсивности сигнала ЭПР. Для измерения скорости перескока фосфолипидов от наружного монослоя к внутреннему определяли снижение сигнала ЭПР при иикубации эритроцитов в той же среде, но без аскорбата.
Результаты этих опытов представлены на рис. 6-4. ж 1 2 у 6 о й ж 1О 0 1 2 3 Времп, и Рвс. 6-4. Уменыпсннс величины сигнала ЭПР от эритроцитов, содержащих спин-меченые фосфо- лнпиды в наружном и внутреннем монослопх плазматической мем- браны (задача 6-7). Плазметическая мембрана 61 А. По результатам, представленным на рис. 6-4, рассчитайте скорость транслокапии от внутреннего монослоя к наружному и от наруж- ного к внутреннему. Удобно выражать такие величины как полу- период транслокации, т.е.
время, за которое половина фосфо- липидов перескакивает из одного монослоя в другой. Б. Из того что вы знаете относительно поведения двух спин-меченых фосфолипидов в задаче 6-6,попробуйте решить, какой из них был использован для мечения внутреннего монослоя плазматической мембраны целых эрнтропитов, а какой †д мечения наружного монослоя. В.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
