Дж. Уилсон, Т. Хант - Молекулярная биология клетки - Сборник задач (1120987), страница 14
Текст из файла (страница 14)
Предложите способ получения эритроцитов, содержаших спин меченые фосфолипнды только во внутреннем или только в на- ружном монослое плазматической мембраны. Мембранные белки 1МБК 6.2) ной средой с обеих сторон клеточной мембраны, называются белками. Б. белки можно выделить из мембран мягкими мето- дами, например экстракцией солевым раствором, тогда как белки можно извлечь только при полном разрушении бислоя детергентами или органическими растворителями. В. Наиболее подходящими агентами для разрыва гидрофобных свя- зей и разрушения бислоя являются — небольшие амфипатические молекулы, образующие в воде мицеллы.
Г. Препараты мембранных белков, солюбилизированных ионным детергеитом додепилсульфатом натрия (ДСН), обычно не пригодны для исследования функций этих белков, поскольку они при такой обработке и, потеряв свою нормальную конформацню, становятся неактивными. Д. Экспериментальная методика, в которой радиоизотопная или флуоресцентная метка, не проникающая через мембрану, используется для того„чтобы выяснить, на каких сторонах мембраны локализованы мембранные белки, называется представляет собой длинную нитевидную молекулу— комплекс из двух очень больших полипептидных цепей, формируюших волокнистую сеть на внутренней поверхности клеточной мембраны эритроцитов. служит в эритроцитах анионным каналом, ответственным за обмен НСО, на СГ при выведении СОэ из тканей организма в легкие. Е Ж 3.
Использование метода в электронной микроскопии позволяет расщепить липидный бислой на два монослоя, причем та поверхность скола, которая представляет собой гидрофобную часть внутреннего плазматического (или протоплазматического) монослоя мембраны, называется , а поверхность, представляющая собой гидрофобную часть внешней половины бислоя, называется И. Пурпурная мембрана бактерии На1оЬас~ег)ит Ьа)о)нит — это особый участок плазматической мембраны, содержащий один белок— ; этот белок превращает энергию света в градиент потенциала и протонов, который служит движушей силой образования АТР. 6-8 Заполните пропуски в следующих утверждениях.
А. Белки, пронизывающие бислой и контактируюшне с вод 52 Глава 6 бактериального типа первый мембранный белок, который был получен в кристаллическом состоянии и изучен методом дифракпии рентгеновских лучей. Подобно липидам мембраны, мембранные белки способны вращаться относительно оси, перпендикулярной плоскости бислоя ( диффузия); многие из них могут двигаться в плоскости мембраны ( диффузия)„но они не могут перемещаться поперек бислоя (путем ). Прямое доказательство того, что некоторые белки плазматической мембраны подвижны в плоскости мембраны, было получено в 1970 г.
в изюцном опыте с использованием гибридных клеток, называемых , которые образуются при искусственно вызванном слиянии соматических клеток мыши и человека. Скорость латеральной диффузии мембранных белков, содержащих какой-либо хромофор или связывающих флуоресцентный лиганд, можно количественно оценить с помо<цью метода К В Г К 6-10 Укажите, какие из следующих утверждений правильные, а какие— нет. Если утверждение неверно, объясните почему. Основу структуры биологических мембран составляет липидный И бислой, но их специфические функции в значительной степени в зависят ог мембранных белков.
Мембранные белки образуют протяженный монослой на обеих поверхностях липидного бислоя. Возможно, что у молекул белков, которые дважды пронизывают липидный бислой, трансмембранные участки полипептидных цепей имеют В-складчатую конформацию. При электрофорезе в полиакриламидном геле с ДСН отдельные белки мигрируют со скоростью, обратно пропорциональной их молекулярной массе: чем крупнее молекулы белка. тем сильнее они тормозятся сложной пространственной сеткой геля и тем медленнее продвигаются от старта.
и" Эритроциты человека не имеют никаких других внутренних мембран, кроме ядерной мембраны. Определить, что мембранный белок экспонирован с наружной стороны плазматической мембраны, можно с помощью ковалент. но связанной метки или протеолитического гидролиза, но только в том случае, если мембрана остается неповрежденной. Спектрин, анкирин, белок полосы 3, белок полосы 4,1 и актив связаны друг с другом нековалентно на внутренней поверхности мембраны эритроцита, за счет чего образуется сетеподобная структура, которая, как теперь считают, обеспечивает поддержани< ел двояковогнутой формы этих клеток.
Каждая молекула бактериородопсина имеет в своем составе одну хромофорную группу, называемую ретиналем; ее активация фотоном света вызывает конформационное изменение молекулы белка, приводящее к выходу нз клетки протонов. Подвижность мембранных белков может быть ограничена в ре. зультате взаимодействия их со структурами, находящимися либе и и< вне,либо внутри клетки.
и ир Участки мембраны могут различаться по составу белков, однак< свиз: пока нет данных об участках мембраны, различающихся по сс стану липидов. анри. икра< Лини Какие из показанных на рис. 6-5 типов связывания белков с мем белк< браной обнаружены в биологических мембранах? Т1лазматикесквя мембрана БЗ Рве. 6-5. Разнообразие возможных овлзой белков с мембраной (задача 6-10). я с- цитопллзмл Белок ~й в ю 6-11 4 НОРМАЛЬНЫЕ "ТЕНИ" гй ен 6-12 Б 'ТЕНИ" ПОСЛЕ ОБРАБОТКИ СИАЛИЛАЗОВ эт :й ое ех тн н- эй ,Т- ко 8 "ТЕНИ" ПОСЛЕ ОБРАБОТКИ ПРОНАЗОЙ ан ги кис й 6-13 уе- бо ко :о- м- ну ию уоо ю 20 Мояекуляояея мееое, у к. ~ы Рве. 66.
Анализ белков, входящих в состав теней эрвтроцвтов, ло к после гвлролиза слелвдазой в цровезой (задача 6-12). Белки, связанные с мембраной, выделены с помощью электрофороза в полиакрвламндном голе с ДСН, а затем окрашены на белок н на углеводы. Линиями показано распределение белков, серым цветом обозначено распределение углеводов. в А у ел ее ел — уняв Чу, ВНЕКЛЕТОЧНОЕ я ПРОСТРАНСТВО Белки, пронизывающие мембрану, обладают характерной струк турой в области бислоя.
Какая из трех приведенных последовательностей, состоящих из 20 аминокислот, более всего подходит на роль тако~о трансмембранного сегмента и подходит ли какая-то нз них вообще? Объясните причины вашего выбора. А. 1ТЫХГОЧМАОЧ1ОТ1ЬЫЯ Б. 1ТР1ХГОРМАОЧ1ОТРЬЫБ В.
1ТЕ1ХРОВМАОЧ1ОТ1)Ь 1Б Для определения того, с какой стороной плазматической мембра ны связаны основные мембранные белки — спектрин, белок полосы 3 и гликофорин, первоначально применяли ферментатнвный гидролиз теней эритроцитов. В этих опытах использовали сиалидазу, которая отщепляст остатки опаловой кислоты от белка, и проназу- для расщепления пептндных связей.
Белки из нормальных теней и нз теней, обработанных ферментом, разделяли с помощью электрофореза в ДСН-полиакриламидном геле, а затем окрашивали на белки либо на углеводы (рнс. 6-6). А. Каким образом информация, содержащаяся в рис. 6-6, позволяет решить, на какой стороне клеточной мембраны находится углевод- ная часть гликофорина: на внутренней, цитоплазматнческой или на наружной, и какие из белков эритроцитов экспоннрованы на наружной поверхности последних". Б. Вы представляете свои соображения коллеге, но она оспаривает ваше заключение о том, что некоторые нз этих белков не экспонированы на наружной поверхности, н предполагает вместо этого, что они устойчивы к гидролизу препаратами проназы.
Какой контрольный эксперимент вы могли бы предложить для проверки такой возможности? В. Как следовало бы модифицировать методику с использованием ферментов для выявления тех белков эритроцнтов, которые прони- зывают плазматическую мембрану? Расчеты количества белков, связанных с мембраной, на клетку и доли поверхности плазматической мембраны, занятой этими белками, важны для понимания структуры плазматической мембраны. Для белков плазматической мембраны эритроцитов это вычислить наиболее просто, поскольку эритроциты легко выделить из крови и в них не содержится внутренних мембран, которые могли бы служить помехой прн расчетах.
С этой целью выделяют плазматическне мембраны, после чего белки, связанные с мембранами, разделяют методом электрофореза в полиакриламндном геле с ДСН, а затем окрашивают красителем Кумасси синим. Поскольку интенсивность окраски в первом приближении пропорциональна количеству белка в полосе, то можно количественно определить белки, как показано в табл. 6-3. 64 Глава 6 Таблица 6-3. Доля красителя, связанного с тремя белками (задача 6-13) Белок Молекулариая масса Процент красителя Спектрин Белок полосы 3 Гликофории 250 000 100 000 30 000 25 30 2,3 Таблица 6-4.
Преципитация мембранных белков зритроцитов антителами, специ. фичными к отдельным белкам (задача 6-14) Специфичиосп» антител Актин Спектрин Анкирин Спектрии Анкирин Спектрин 1. Белок полосы 3 + актин 2. Белок полосы 3 + спектрин 3. Белок полосы 3 + анкирин 4. Актин 4 спектрин 5. Актин + анкирин 6. Спектрин + викарии Актин Спектрин Белок полосы 3 + аикириа Актин 4 спектрин Анкирин Спектрип + анкирин ный ой Рис. 6-7.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
