В.И. Иванов - Генетика (1117686), страница 84
Текст из файла (страница 84)
Метод Сантера или дидезоксисекаенироаание оснонан на синтезе изучаемой цепи ДН К )п ийго с остановкой синтеза на заданном оснонании путем присоединения дидезоксинуклеотида. Дддезоксинуклеотид лишен гидроксильных групп при атомах сахарного кольца не только в 2'-, но и в 3'-положении, что делает его неспособным формировать фосфодиэфирную связь со следующим нуклеотидом. Такие диде юксинуклеотиды получают путем синтеза. Для проведения секвенирования необходимы: секаенирующий праймер (искусственно синтезированная олигонуклсо~идпая цоследоаательность, комплемецтар- 352 Часгнь г' Общгом славики ная определенному участку исходной молекулы ДН К), четыре пробирки с набором из четырех дезоксинуклеотидов с(АТР т(СТР т(ОТР и т(ТТР один из которых изотоп- но меченный соответственно добавляемому одному из четырех дидезоксинуклеотидов (тЫАТР сЫСТР, тЫОТР и тЫТТР), и ДН К-пол имераза.
Сам метод включает следующие этапы: 1) гибридизацию изучаемого фрагмента ДНК с праймером, 2) ферментативный синтез ДНК, 3) денатурацию полученных продуктов формамидом (в результате образуются уникальные различающиеся по длине олигонуклеотидные последовательности, содержащие праймер), 4) электрофорез в полиакриламидном геле на четырех дорожках (по числу типов нуклеотидов) и 5) анализ результатов на радиоавтографе. На большинстве радиоавтографов можно четко различить 250 — 350 полос, т.е. прочитать последовательность в 250 — 350 п.н. Нуклеотидная последовательность на радиоавтографе считывается снизу вверх (рис.18.10, а). Таким образом, по размеру синтезированных фрагментов может быть определена локализация дидезоксинуклеотидов и порядок соответствующих им нуклеотидов в исходной молекуле ДН К.
Для прочитывания более длинных последовательностей существует ряд методов, представляющих собой разные модификации метода Сантера. Эти методы основаны на предварительном клонировании ДНК в векторах, сконструированных на основе Рис. 18.10. СеквенированиеДНК. (ПредоставленоТЭ.
Иващенко) а — этапы дидезоксисеквенированин по методу Сантера; б — автоматическое дидезоксисекве- нирование /лини !у пи«мили им нимич«м«хполм ив ~)«пи М 13 Егия !щя получе~ ~ив про~яжгшп и <нпппкчи|чечных участков ДНК, которые мо~угбыть пспосрсдствснносекпеппрнтщгы(ютдспатурации и праймпрования. Особенность фага М ! 3 Есой состоит и возможности его существования в двух формах: двухцепочечной репликативной, функционирующей как плазмида, и олноцепочечной фаговой, использующейся в качестве матрицы для секвенирования.
Выделив после клонирования одноцепочечные фаговые ДНК со вставкой (размер около 500 п.н.), праймер гибридизуют с последовательностью вблизи вставки, и проводят дидезоксисеквенирование. Для секвенирования крупных фрагментов ДНК (около 2000 п.н.) используют более слохсные (комбинированные) подходы. Один из них заключается в предварительном клонировании данного фрагмента в плазмидном векторе и построении его подробной рестрикционной карты, идентификации перекрывающихся рестрикционных фрагментов длиной 100 — 500 и н. Далее, субклонировав каждый из этих фрагментов в ДНК М ! 3 Есор, их секвенируют и определяют последовательность исходного участка ДНК. Так как субклонированные фрагменты могут быть встроены в противоположных направлениях, то праймер в одном случае будет инициировать синтез первой цепи, а в другом — компле ментарной ей, а значит возможно одновременное секвенирование обеих цепей.
Для секвенирования фрагментов ДНК более 5000 п.н. используют методы секвенирования двухцепочечных плазмидных ДНК, не требующие субклонирования. Один из них носит название «праймер-опосредованной прогулки» («блуждающей затравки»). Суть метода заключается в последовательном дидезоксисеквенировании по 250 — 350 п.н. Этапы метода представляют собой цепочку циклов, включающих синтез праймера, дидезоксисеквенирование и идентификацию нуклеотидной последовательности (рис. 18.11): 1) отжиг плазмидной ДНК, содержащей вставку, с праймером, комплементарным последовательности одной из цепей векторной ДН К; лидезоксисеквенирование и идентификация первых 250 — 350 п.н. вставки; 2) си|ггсз второго праймера, комплементарного сегменту вставки, который отстоит от места связывания первого праймера примерно на 300 п.н., и секвенирование слсдукяпих 250 — 350 и н., и так далее, пока не секвенируют весь фрагмент Обязательное условие при секвенированни очень длинных фрагментов иметь праймер длиной не менее 24 нуклеотидов.
Это необходимо дая тото, чтобы избежать спаривания праймера внутри вставки более одного раза. Этим методом были секвенированы фрагменты ДН К, клонированные в бактериофаге Х (=20 т.п.н.) и космидном векторе (=40 т.п.н.). В настоящее время широкое распространение получила методология автоматичсско- го ДН К-секвенирования с использованием меченных различными флуорохром ам и дилезоксинуклеотидов — электрофорез в этом случае проводят на одной дорожке и на злектрофореграмме каждому из нуклеотидов соответствует свой цвет полосы, которую сканируют в луче лазераа, занося данные в компьютер, который сопоставляет их и идентифи~ !ирует, выводя на экран нуквеопщную последовательность (см.
рис. 18.10, о). Этот могол широко применялся входе реализации программы «Геном человека». Использование автоматических секвенаторов снизило сюим ость секвенирован ия одного звена с 1» до О, 1,», Однако существуют еще более быстрые методы автоматического секвенироюния. Один из них — секвенирование путем гибридизации исследуемой последовательности ДНК с набором олигонуклеотидов (олигонуклеотидной матрицей), вклю- Чттгтю б ОГттци» венвлтцка Зо4 ДНК-вектора Рис. 18.11. Секвенирование методом праймер-опосредованной прогулки («блуждающей затравки») чающим все возможные варианты перестановок из 4 стандартных нуклеотидов (А, С, С, Т) определенной длины. Наиболее удобными считаются наборы матриц (чипы) из октануклеотидов., при этом количество возможных вариантов нуклеотидов состашгяет 65536. Секвенируемый фрагмент ДНК, меченный радиоактивным фосфором, гибридизуется только с комплементарными его участкам октануклеотидами.
В результате определяется спектр октануклеотидов, составляющих исследуемый фрагмент ДН К. Локализация октамеров в изучаемом фрагменте ДНК устанавливается при помощи специальной компьютерной программы. 18.1,4. КАРТИРОВАНИЕ И СКРИНИНГ ГЕНОМА Секвенирование к 2003 г. всего генома человека позволило значительно облегчить процедуру картирования, так как анализируя уже известную нуклеотидную последовательность определенного региона можно более точно и быстро выбрать геи-кандидат для подтверждения его роли в развитии наследственного заболевания. Расшифровка генома позволила упростить и процесс построения физических карт. Однако знания первичной структуры ДН К не достаточно для определения функциональной роли той или иной нуклеотидной последовательности.
На повестке дня формирование нового направления программы «Геном человекаь — функциональной геяомцки. В связи с этим построениегобновление карт генома не потеряло своей актуальности. 18Л,4Л, КАРТЫ ГЕНОМА И МЕТОДЫ ИХ ПОСТРОЕНИЯ Карта генома — это схема, определяющая хромосомную принадлежность и взаиморасположение (порядок и расстояние) генов и других компонентов генома. Карты генома можно классифицировать по объему предоставляемой информации (разре- Гвипп с'д йппмикп сс ч'ссссмсссчс спекппппеии ппнопссй гпнюобности) и методам построении. й гаписимосги от разрешающей способности выделяют мслкпмагттидпме ксс)»сы (с низким уровнем разрешения), например, каргина диффсрснциюшносн окрапсивания хромосом или генетические карпя с расстоянием между соседними маркерами в 7 — 10 миллионов п.н.
(мешбаз— Мб), и крупссамаеистайпые, в идеале — полная последовательность нуклеотидов. 11о методам построения различают физические и генетические карты (карты спсплсс с ив). Физические карти целой хромосомы или ее сегмента строятся на основе прямос о исследования генетического материала и дают представление о реальном расположениии генов вДН К, расстояние между которыми и фланкирующими их маркерами вырви нпвя в и н., что облегчает их идентификацию и изучение, а также секвенирование. йеск птчеекие карты показывают линейное расположение маркерных сайгон, расстояние между которыми измеряют в сМ (сантиморган — условная единица частоты рекомбинш сии; см.
гл. 7). Расстояние между покусами равно 1сМ при частоте рекомбнации 1% и соответствует физическому расстоянию приблизительно в 1 Мб (1 млн. п.н.), Частоты рекомбинации, а значит и реальная длина 1сМ, варьируют в различных частях генома, что обусловливает возможность получения лишь ориенпгровочной информации о физическом (реальном) расссоянии при использовании генетических карт. Физические карты хромосом н методы нх построения. В зависимости от используемого метода можно получить физические карты хромосом с различной степенью разрешения. Соответственно этому выделяют мелкомасштабные физические картьп к которым относятся цитогенетические (хромое омные) и транскрипционные (картта кДН К), и крупномасштабные — макрорестрикц ионные карты и карты конти г.
Фи зические карты можно построить как для всего генома, так и для изолированной хромосомы. Изолированные хромосомы можно получить путем сортировки хромосом сс потоке по размеру (проточная цитометрия), а также из гибридных клеточных линий (гибридные клетки «человек х мышь» при делении теряют преимущественно чссювсческие хромосомы, в результате чего остается лишь одна хромосома, такую гибридную клетку размножают и поддерживают клеточную линию).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
