В.И. Иванов - Генетика (1117686), страница 85
Текст из файла (страница 85)
При необходимое си получения больших количеств определенного фрагмента дНК при пострсссссии крупномасштабных карт используют методы ПЦР и клонирования. цитогенетнческие карты дают информацию о расположении гена на хромосоме относительно ее участков, идентифицируемых методами дифференциального окрашивания. Благодаря такому окрашиванию хромосома в поле зрения микроскопа выглядит «поперечно исчерченной». Расположение окрашенных участков (бэндов) специфично для каждой хромосомы (см.
гл. 19). Использование Р!ЯН-метода позсюляет построить цитогенетические карты с разрешением 2 — 5 Мб, а его модифик;испи для интерфазных хромосом — 0,1Мб. Таким образом, локализация картировасшоп1 с помощью Р!ЯН-метода гена может быть установлена с точностью до субсегмента и покуса бэнда. Например, согласно принятой цитогенетической номенклатуре !БС~)- 1995 и номенклатуре используемых в качестве маркеров сегментов ДНК с неизвестсюй функцией, запись 22с!11.2 (г)22975) означает, что ген локализован во 2-ом субсегменте 1-ого сегмента 1-го района длинного плеча хромосомы 22 методом гибридизации ш з1(в в локусе 022575 (Π— ДНК, 22 — )ч» хромосомы, Я вЂ” уникальный маркер, 75 — ) (» зонда в данном районе хромосомы). 35ь Часть /, Общая генетика Транс крипннонные карты предоставляют информацию о расположении на хромосоме кДН К, что позволяет выявлять гены-кандидаты лля тех или иных заболеваний. Нскусственно синтезированные с использованием в качестве матрицы мРНК или "нмическим путем (по известной аминокислотной последовательности) и меченые хДН К-зонды локализуют методом гибридизации ш а(Гц.
Другой, более перспектив"мй, метод построения транскрипционной карты основан на частичном секвенировании отдельных кДНК-клонов и выявлении специфических маркерных сайтов (уга — эеаиепсе гащес( ейеэ), называемых экспрессируемыми маркерпыми сайтами (еЗТЯ). Для определения хромосомной принадлежности еБТВ-сайта проводят ПЦР с ДН К монохромосомных гибридов с использованием еЯТВ-праймеров. Далее, про"едят ПЦР с ДНК клеточных линий гибридных клеток, содержащих только определенные фрагменты конкретной хромосомы человека, и устанавливают локализацию еВТЯ на хромосоме, Также картирование можно осуществить нанеся еВТБ методом гибридизации 1п айв на карты радиационных гибридов.
Макрорестрикннонные карты — дают информацию о взаиморасположении сайтов Рестрикции редкощепящих рестриктаз и расстоянии между этими сайтами. Такие карты получают в результате последовательного разрезания ДНК отдельной хромосомы различающимися по сайту узнавания рестриктазами и упорядочения получае- М! ~х фрагментов после обработки каждой рестриктазой (собственно физического харгирования). При одномоментном использовании нескольких рестриктаз получак>г фрагменты ДНК, соответствующие по длине расстоянию от концов молекулы ) (Н К ло сайтов рестрикции, и фрагменты, размер которых соответствует расстоянию Между сайтами рестрикции. В любом случае для физического картирования исходной молекулы ДНК необходимо знать расположение одного из использованных ПДРФ-сайтов независимо от количества локализованных в этой молекуле сайтов рестрикции.
Мечение рестрикционных фрагментов позволяет автоматизировать пРоцесс. Преимущество этого метода состоит в возможности получения полных, без нРобелов, карт достаточно больших участков хромосомы. Разрешающая способность такой карты варьирует от 0,1 Мб до 1Мб, что однако ниже чем у карт коптит. Контнг — это набор упорядоченных перекрывающихся клонов ДН К, охватываюи ьих всю хромосому или какой-либо ее участок.
Охватываемый конти том участок изМерястся в п.н. До полной расшифровки генома человека контиги служили основой для построения окончательных вариантов физических карт. Контиги были получены на основе ЧАС-, ВАС-, РАС-, Р1-, Х- и космидных библиотек дНК человека. Для построения контигов из геномных библиотек, содержащих крупные вставки (гАС-, ВАС-, РАС-библиотеки), используют метод картирования, основанный на обнаружении в индивидуальных клонах библиотеки различных маркерных сайтов (ВТЯ). Таких сайтов (как правило, это короткие тандемные повторы 2 — 4 нуклеотидон) в геноме человека идентифицировано около 10 000.
Зная распределение маркеров н клонах, рассчитывают вероятный набор перекрывающихся клонов и определяюг относительное расположение имеющихся маркерных сайтов. Контиги из небольших фрагментовДНК, полученные из Р1-, Х- и космидныхбнблнотек, более удобны, Наиболее часто для построения контигов используют косМидные библиотеки, перекрывающиеся клоны которых идентифицируют методом ге~ ю мной дактилоскопии. ДН К каждого клона, обработанная рестриктазой, форми- |зт Глава И 1«комика и ееномнме |некноногин рус| уникальный набор фрагментов, вьщ|щясмых | и злектрофореграмме илн радио;ппографическими методами, в зависимое| и от способа нанесения метки. Для орщпизации контига из анализируемых клопов проводят поиск меченых рестрикционных фрагментов (общих для пары клопов) с помощью компьютерных программ.
Наличиеие перекрывающихся участков в клонах контига подтверждается построением их рестрикционной карты. Пробелы между контигами (поиск недос|аюших участков) заполняют путем скрининга библиотек нз крупных вставок, используя зонды из ближайших концов соседних контигов. Процесс определения места положения и взаиморасположения генов, кДН К или каких-либо маркеров гсайтов узнавания рестрнкгазами, БТБ-маркеров), присутствующих в исследуемой молекуле ДН К, называот физическим картированиеи.
Генетические карты и методы их построения. Построение генетическим карт осно вано на анализе сцепления полиморфных маркеров с хромосомами и сцепления определенных генов с этими маркерами. Оценку сцепления между генами проводят на основании статистического анализа сегрегации признаков в родословной методом максимального правдоподобия, подсчитывая десятичный логарифм шансов (1ой ог" 11|е ойЬ), или ЕО1)-балл.
Шансы рассчитывают как отношение вероятности наблюдения родословной с наличием сцепления двух генов (часгота рекомбинации меньше 0,5) к вероятности наблюдения родословной с отсутствием сцепления этих генов ( |астота рекомбинации равна 0,5). Гены сцеплены при ЕО1) > +3, н не сцеплены— при ЕОО < — 2. Методика анализа сцепления подробно описана в гл. 19. Методика построения генетических карт включает: формирование групп сцепления генов, контролирующих различные наследственные признаки; исследование взаимного расположения генов в этих группах н определение соответствия межлу генетическими группами сцеплен||я н цитогенетнчески идентифицируемыми фрагментами или целыми хромосомамн. Для построения полных карт сцепления необходимо наличие в покусах каждой хромосомы часто встречающихся аллелей (маркеров), принадлежность которых можно идентифицировать.
Для картирования генома человека в качестве таких маркеров в основном используют мнннсателитные повторы типа БТК (от англ. хлоп ган0еч гереа|з). Карты сцепления хромосом человека постоянно обновляются по мере идентификации дополнительных полиморфных маркеров н локализации признаков. В результате разрешение карты постоянно повышается. К настоящему моменту в геноме человека установлена локализация примерно 6000 полнморфныхДНК-маркеров, среднее расстояние между которыми =1 сМ. Нв таком участке может локализоваться около 10 генов.
18.1.4.2. СТРАТЕГИИ КАРТИРОВАНИЯ ГЕНОВ ЧЕЛОВЕКА И МЕТОДЫ ПОЛНОГЕНОМНОГО СКРИНИНГА Выбор стратегии картирования гена определяется имеющейся информацией о продукте гена и(или о функции гена. Существует две основных стратегии: «орнман гене|ники» вЂ” основанная на принципе «отбелка к гену», и «обрил|чан гелен|ок໠— «от гена к белку» и «от нормы|ыюго гена к мутантному аллелю», Естественно, что первы- 1хв Чттт, д Обман генетика ми были исследованы те гены человеки, продукт которых был охарактеризован на уровне белка, а метод картирования, осповашп гй на стразегии «прямой генетики» получил название функционального картнровапня. В большинстве случаев ни о природе конкретного гена, ни о его продукте, ни о механизме патологии, вызываемой мутацией этого гена, ничего не известно.
Это привело к необходимости разработки новых подходов к карти ровани ю генов, основными из которых являкпся х ан— дидатяае, позиционное и позиционно-кандидатиое хартирование. Однако независимо от используемого подхода необходимо подтверждение ассоциации гена сданным заболеванием путем обнаружения у больных изменений нуклеопш ной последовательности этого гена, отсутствующие у здоровых.
Функциональное картированяе используется при известном продукте гена и включает следующие этапы: определение аминокислотной последовательности белка (или выделение мРН К) и реконструкция кДНК; синтез олигонуклеотидного зонда и скринннг кДНК-библиотек для вьшеления кДНК-клона; установление хромосомной локализации гена-мишени (методом гибридизации )п зйи или др.); скринирование контигов, охватывающих район локализации гена-мишени, для определения клонов, гибридизующихся сданным кДНК-клоном; секвенирование позитивных клонов и характеристика гена-мишени (выявление мутаций). С использованием этого подхода у человека были картированы гены гемоглобина н факторов свертывания крови.
Каидядатное картировацие основано на выборе белка-кандидата, аномалии которого могут привести к симптомам изучаемого наследственного заболевания. Далее выбирают ген1ы)-кандидат1ы), исходя изданных о нуклеотидной последовательности всех клонированных генов, и вырабатывают стратегию поиска мутаций для подтверждения/опровержения ассоциации гена-кандидата и изучаемого заболевания. Данная стратегия не очень эффективна для картирования генов болезней человека, что обусловлено недостатком информации о них. С другой стороны ценность отрицательного результата определяется возможностью исключитьданный ген из списка ответственных за данное заболевание.
Наиболее успешно этот метод применяется при картировании генов мультифакториальных заболеваний: так были исследованы некоторые гены, продукты которых участвуют в патогенезе сосудистых заболеваний и диабета. Позиционное картировацие 1клонирование) — наиболее перспективный метод картирования локусов различных наследственных заболеваний с неизвестным биохимическим дефектом. Этот метод, предложенный в )980 г., основан на анализе сцепления между геном заболевания и аллелями полиморфных ДНК-маркеров в семьях, что стало возможным лишь при построении подробной генетической карты генома человека.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
