В.И. Иванов - Генетика (1117686), страница 82
Текст из файла (страница 82)
яКлассический» метод геномнпй дактнлоскопнн предспвляет собой гибридизацию по Саузерну (см. 18.1.2.1.) фрагментов ДН К, полученных в результате рестрикции и разделения в агарозном геле. В качестве зондов для гибридизации используется минисатсллитная ДНК с длиной мономера от 9 до 40 п.н, и количеством его повтора от 10 до 30. Для установления или опровержения идентичности исследуемых образцов ДНК необходима последовательная гибридизация с 4 — 5 радиоактив- Рис.
18.7. Результаты ПДРФ-анализа при прямой и косвенной ДНК-диагностике а — прямая ДНК-диагностика (нукпеотидная замена я гене расположена я сайте узнавания рестриКтазы Н): дорожка 1 — гомозигота по нормальному аппепю; дорожка 2 — гетерозигсга по нормальному аппелю; дорожка 3 — гомози гота по аппепю с точ козой заменой е сайте узнавания рестрикгаы Н (нукпеогидная замена привела к отсутствию сайгу узнавания даны последовательности ресгриктазой); б — косвенная дик-диагносгикз депеций (сайт рестрикции фпанкирует область дел еции):дорожка 1 — нормальная гомозиготз; дорожка 2 — депе ция в гетерозиготном состоянии (присутсгвует фрагмент другой длины); дорожка 3 — депеция в гомозиготном состоянии (отсутствует один из фрагментов, имеющихся е норме).
lяинп И й11итгпки и гсиомиыг технологии и АГ С Ч ~г — 159 155 163 1 59 — ~. 155 1Л9 ~. 1л5 1Л1 — 151 — 1Л7 — 1ЛЗ 110 106— 1О2 96— 9Л 9О 1О — 1ОЛ 1ОΠ— 96 — 92 но меченными зондами. После каждой гибридизации на радиоавтографс визуалнзт руют и сравнивают между собой наборы различающихся по длине фрагментов, соо' ветствующих мннисателлитным последовательностям образцов дНК. К недосп1 кам данной методики идентификации биологического материала можно отг1сс~ значительную длительность исследования 1от нескольких недель до нескольких и сяцев) и необходимость достаточно большого количества дН К рис.
18.8. установление биологического родства путем анализа миннсателлитных мар ксров глиагностика отцовства) а — принципиальная схема диагностики кровного родства а сем~е из трех человек 1 — предполагаемый отец; 2 — мать; 3- ребенок; б — фрагмент электрофореграммы рвзул1пп тов Пдрф-анализа при установлении биологического родства в семье из трех человек по днук Ятн-маркерам. С! и с2 — аллельные лзддеры, по которым проводится определение дни~и фрагментов и, соответственно, числа мономвров в повторе, яŠ— предполагаемый отец, С ребенок; М вЂ” мать. 346 Чаем» б Общаа геаемааа В последние годы для обнаружения различяыхмхяи- и мяхросателлятяых последовательностей стали использовать различные модификация лцлимернной цепной реакции (мульти плексная ПЦР, ПЦ Р с исцольюцаиием мечеяьц нуюьестьшов).
На сегодняшний день наиболее эффективным (те. достоверным, яе требующим большого количества биологического материала и достаточно быстрым) методом идентификации личности считается сравнительньй электрофоретячесхяй аяализ фрагментов ДНК, полученных в резулыате мульшмексяой ПЦР БТК(от англ. а)ьап голь(ела гереап)-последовательностей — тримеряьц х тетрамеряых коротких тавдеыных повторов.
Пример установления биологическою родства(дяагяостихя отцовства) данным методом представлен на ряс. ! 8 8. Одни цолоцина полос »ДНК отпечатка» ребенка должна соответствовать таковым у отца, а другая — у матери. Аналогичные методики используются и для ДНК-дяап юсгякя заболеваний. При прямой ДНК-диагностике, например, болезней, об)словлеяяьц экспансией тряяуклеотидных повторов (8ТК) в регуляторных яли траяскрябяруеььых частях генов, выбор метода анализа количества повторов зависит от их протяженности ври числе повторов менее 200 для генотипировапия аллелей используют зцекг)юфоретицескяй анализ амплифицированных АНТК, в случаях больших размеров участка повторов используют метод блот-гибридизации с состветствуюшимя зовдшчя. Для косвенной диагностики наследственных заболеваний применяют анализ количества микросателлитных (динуклеогидных) повторов.
Наиболее часто используют СА-повторы, локализованные в иятронах исследуемых генов яля в яелцсредственной близости от кодирующей части гена. Анализ полиморфизма мини- и микросателлятлых цоследовательяцсзей везаменим и при карти ровании. Определив генотипы всех членов родословяой, можно установить сцепление маркера с геном заболевания. 18Л;3. МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ МУТАЦИЙ Наиболее эффективный способ выявления мушцхй — секценироваиие хДПК яля отдельных экзонов. Довольно часто первичный поиск нарушений в кодяруюшях областях гена осуществляют именно таким образом. Дця генов, ямеющяхсравнятельнонебольшие размеры(например, генфактора)Хсвертываняякрови,детермяяицующи й гемофилию В), метод прямого се к вен ироваяяя иногда используют как основной метод сканирования мутаций.
Однако, несмьл)эя на наличие методик (различные модификации ПЦР использование мРНК цлц получения кДП К), переводя ших секвенирование в разряд рутинных методов, секвенироваяяе полноразмерной кДНК (те. всех экзонов) для выявления мутаций у огдецьяых индивидов остаетсх трудоемкой, дорогой и требующей больших затрат времеви процедурой Поэтому ца практике полученные путем амплификации иля клонирования фрагменты ДПК предварительно тестируют на наличие мутаций более простыми методами, осномнными на сравнении физико-химических характеристик мушитиых и нормальных последовательностей. Однако точные молекулярные характеристики каждой мУгации независимо от ее природы (замены ь ьуклеотилцц делении, дуцликцяия, ицсер- аввы и главе уй йгимлха и гтеьлне меогаьеггггг 18,1,3,1Л7ЦР АНАЛИЗ КАК МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ МУГАЦИИ С помошьюПцРипослслуквцеш этеюрш)юремпралукювкхгшгиФиюгггии вгххггцлгхг.
лшгндном шгиагарозном гелеобанарулжваюпбтаии, ггзлишгюшисдлиггуаигеггхйгиь роинцгых фрагьгентов. К шктш ьгуюшми просятся делении и инссрцни. делецяи регистриручот по разнице в рюмерат и числе юшлифицнрованкых флаг. ментов на электрофорсграмме нормальною в иугантного сбразцов ДНК, При ото)т. стони делений на злекгрофореграмме вьисляюгся все аыплифицироюлные фуп. менты в виде соогветствуюцшх полос. Небольшие по размеру делеции и инсершш лишь слегка меняют рюиерыаижв.
фицированных фрагменювДНК Именно так была обнаружена в геиеиуковисица. заделецин трех нуклеотидов-гУЕ508 ггл, 2!). Протяженные дслецин в генах, нкходчшгцся в состоянии теми- илигоишзлшяе. сти, выявляют при элекгрофорезе продукшв музыиплексной аьгптггфхкавкк зюг. нов, наиболее подверженных такой мутации.
Если в исслелуемом обрюцедйй ш. кис-пт экзоны делепгрованы, то на зле ктрофореграмме соогвегствуюшяе ни мисси отсугсщют. Испощм персхрьгююшиеся )часпш гена для амцчифюллигг, южно оценить размер делеции и опуедсчггть ес внугригенную локачиэтшгм, эгш ишгг применяютдля аыявлениядетецшг вгенедистрофина (ш.22). Для обнаружения протяженных делений, находяшася в гетсрозиютнемшсмг. юг и, ьюпольюуют мульт ниле ксную ПИР с обязательной количественной оцевхвг ус. зультатов ам юг ификацни (коюгчеетвеииая ППР). Этот метод основан на шшггфгпь цни кДНК, полученной п ушм обратной т)м искрил пигг из эктотг тха иРВК км из мРНК, нктвированной из экспрессируюших данный ген тканей нггг кульпр кте. ток пациенш. В качссше олигопраймеров лля ПЦР испальзуюг постшшамхьнхггг иэ фланкируюшик делецию экзонов гена.
Пря аиплнфикации будут воз)чшн звм фрапиенты ьгушгпногй молекулы кДНК, небзхьшие по размеру ваелськгк бвошп распсложсне граничаших сделсцнейэкзонок Учасшкмсжлуфланюррощагпки. пню зкюнаьш в нормальнойиолекуле кДНКмажетбьпьслишкомвслвхлляащнггфн ктцни при выбранньпусловикх На практике проводят мул ьтиыексную ПЦР с использованием набора амге.
праймеров, обеспечивающего амплифвкацию фрагментов, полносцю ле)ххрьаю. щих асю молекулу гдНК, Наличие делепии регистрируют по пояюшию прцюез амплификации необычного размера. 18,1,3,2,ВЫЯВЛЕНИЕТОЧКОВЫХМУТАЦИЙ Выявление ьгутьци й, предста вчяюших собой замену одного или несщтыггт в) юегтидов, с помо шлю П ЦР-а наг ига невозможно Рина и ушггтгггтго фрагггецгьйй бес. тается прежней; нарушасзсялишьконформьцноннаяструктурц гюгесгес~кгглле. которые физико-химические свойства молекулы Д) ) К. Длг«юшрулгнях нугглггй" инде замен используют анализ когг4х ггтытизгггггг ггг г ггггггггыггу х)гн ги ге тга мгах хгс юла ДНК гВВСР) и метод депатурнрпонн ш птиишг ничо ггчгг гггехгрь)о)хи у)кйгП Ещелва метода гтыягшсиигг пммьчю мюгшил и'ггзюггтшшхг пылаю игг(пл) хих.
348 Чагпп I. Обивках:енеаики мическое расщепление некомплементарнгах сай гоп (СМС) — основаны на возникновении структурных нарушений в месте нспзмологичного спаривания прн гибридизации нормальной и мутантной цепей ДН К. Все этн методы анализа амплифицнрован ных продуктов (кроме СМС-метода) для точной идентификации точковых замен в обязательном порядке предполагают секвеннрованне. Схематическое изображение принципов и методов идентификации точковых мугапнй представлено на рис. 18.9. Анализ конформационногп полнморфизма одиоцепочечной ДНК (ВВСР— от англ. аих1е гига сочГоппайпп ро1утогрййт).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
