В.И. Иванов - Генетика (1117686), страница 81
Текст из файла (страница 81)
Библиотеки, созданные на основе тотальной геномной ДНК и включающие экюны, интроны и межгенные участки называют генамными. Информационная емкость геномных библиотек млекопитающих составляет не менее 8.10ь — 10ь . Фрагменты оптимального размера из геномной ДНК человека получают при рестрикции частощепящими рестриктазами Бац ЗА или МЬо!. Библиотеки кДНК состоят только из экзонов. Их конструируют из кДН К, полученной с помощью обратной транскрипции мРНК, которая выделена из биологического материала, экспрессирующего изучаемые гены. Различают библиотеки экспрессирующихся кДН К и селективных кДН К.
Получив ДНК(кДН К, ее разрезают на фрагменты, длина которых зависит от выбранного кпонирующего вектора, и конструируют векторную систему. В зависимости от выбранного дпя клонирования вектора различают УАС-, ВАС (Ьасгег(а! агг(бе(а! сйготалотел)- и РАС (р!алтЫ агв))с(а( сбгатолател)-библиотеки, соцержащие крупные фрагменты ДНК человека.
Фаговые (Р! и ).) и космидные библиотеки генов наиболее удобны для хранения больших количеств химерных ДНК. Для создания библиотек генов в основном используют фаговые, космидные и УАС-системы. гАС- библиотеки генов представляют собой фрагменты геномноИ ДНК человека размером цо 1 млн п,н,, «сшитые» с центромерными раИонами хромосом црожжеИ. После илентификации необходимого клона УАС-библиотеки вставочный участок может быть субклонирован в фаговых или космидных библиотеках. Наиболее удобно библиотеки генов человека конструировать, используя клонирующие векторы на основе фага г.
— ЕМВИ и ЕМВМ. Это обусловлено характеристиками векторов: интервалом пакующей способности — 9 — 23 т.п.н,; наличием большого количества уцобных кпонирующих саИтов (что позволяет использовать разные рестриктазы при получении фрагментов ДНК для инсерции); отсутствием последовательностей плазмид рВК322 и Со!Е!, наиболее часто используемых дпя клонирования (что позволяет ~ ~ро юлить отбор нужных клонов с помощью фаговой ДНК, не вырезая вставку). Скринируя библиотеки генов, осугцестапяют поиск нужных последовательностей ДН К. Выбор метода скрининга зависит от специфических особенностей этих послелопательностей.
Для скрининга библиотек, как правило, используют блат-гибридизацию с ДН К-зонцами (олигонуклеотидными, кДНК- и цругими) или иммунноблот со специфическими антителами (если библиотека сконструирована на основе экс- 42 Часть й Общая генетика |рессируюшего вектора). Скрининг включает несколько послецовательных этапов: плсевание химерных фатов библиотеки на газон бактерий, растущих на поверхности всрцой питательной среды в чашках Петри (каждая литическая бляшка на бактеришьном газоне — результат инфицирования клеток оцним клоном фага); «перепеча'ы вы ~ ие» полученных культур на цругие чашки Петри с целью их дублирования; пеюпос растущих и лизированных исходных колоний на фильтр с одновременным ъ грущснием клеточных мембран, фиксированием белков и ДНК; блат-гибридиза!ия с меченым ДНК-зондом или иммуноблот с мечеными антителами (для экспрес:ионных библиотек). Заключительный этап скринннга включает выявление полокительных колоний фагов методом радиоавтографии (после уцаления несвязавших;я Д11К-зондов и антител темные пятна на рентгеновской пленке обнаружатся в мелах локализации колоний, соцержащнх комплементарный зонду фрагмент ДНК, или специфический антиген) и их отбор на дублированных \сультурах.
С целью избежания ошибок проводят неоднократный скрннинг отобранных колоний. Далее для получения достаточного количества отобранного фрагмента с целью его исследова- ~ ~ ия или использования в качестве ДНК-зонда его субклонируют в плазмидном векпьрс. 18.1,2.3. МЕТОДЫ ПОИСКА ДНК-ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ, ОСНОВАННЫЕ НА ПОЛИМОРФИЗМЕ ГЕНОМА 11ослецовательности ДНК человека идентичны между собой на 99,8%, однако, осшншиеся 0,2% генома человека характеризуются значительной вариабельностью. Исследования генома, позволившие установить наличие вариабельных участков, а также широкое внецрение метода ПЦР, позволили разработать более легкие методы идентификации фрагментов ДНК, основанные на полиморфизме генома.
Эти методы имеют ряц преимуществ: !) можно использовать один и тог же (универсальный) ~ ~абор ~ ~раймеров, 2) нет необхоцимости в ДНК-зондировании, гибридизации и тд., 3) возможность автоматизации анализа результатов. Все это позволяет быстро охаракзвризовать большое количество образцов. Как известно, полиморфизм генома обусловлен, главным образом, наличием полиморфных покусов, прецставляюших собой нейтральные мутации, не проявляющиеся фенотипически и не влияющие на жизнеспособность и репродуктивные свойства особей (гл.
13). Такие покусы сконцентрированы в некоцирующих областях генома 1еловека, более подверженных изменчивости, чем кодирующие участки. 11вслсцование полиморфных покусов подчиняется менделевским закономерностям. Ищ!хзрмативность полиморфных покусов определяется уровнем их генетической и ~мс~ щ нвости в различных популяциях. С помощью молекулярных методов анализа наиболее просто выявляются цва типа ~сномного полиморфизма: !) количественные изменения мини- и микроеателлитных пгкледовательностей ДНК (уменьшение нли увеличение числа повторов), создаюп!ис целую серию уникальных по характеру и частоте аллелей для каждого вариабслы юго покуса, и 2) качественные замены отдельных нуклеотидов, обусловливающие Раааа 18 1еппмика и ееиампые техаатыии пппнлепие полиморфпых сайтпн рестрикции.
Эти ти~ и ~ пол имо(х(п пах покусов предающими! собой наиболее удобные генетические маркеры, Анализируя родословные можно проследить наследование аллслсй этих маркеров в ряду поколений, определить сцепдениедругсдругом, с известными Вшами и с анонимными последовательностями ДНК, что широко используется как для картирования геномов, так и для косвенной диагностики наследственных заболеваний. Феномен ДН К-полиморфизма лежит в основе двух распространенных в настоящее время методов идентификации мугантных фрагментов ДНК: анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов и анализа микросателлитных маркеров. Анализ полиморфязма длины рестрякцяоивых фрагментов (ПДРФ-анализ).
Присутствиее в ген оме поли мар фиых сайтов рестрикции обусловливает вариацию (полиморфизм) длины рестрикционных фрагментов (ПДРФ). В геноме чеяовека такие полиморфные сайты рестрикции встречаются во всех хромосомах с частотой приблизизельно 1: 300 — 500 п.н. Этот метод используется для предварительного уточнения локализации мутации при наличии в амплифицированном фрагменте известных сайтов рестрикции и ддя выявления уже известных точковых замен, меняющих сайт узнавания рестриктаз. Для этого продукты амплификации разрезают соответствующей рестриктазой и на злектрофореграмме сравнивают длину изучаемых рестрикционных фрагментов с контролем.
При необходимости полученные фрагменты идентифицируют, используя метод блот-гибридизации по Саузерну. ПДРФ-анализ можно использовать для диагностики гетерозиготного носительства мутаций, При наличии точковых мутаций в гетерозиготном состоянии по данному сайту рестрикции на электрофореграмме будут выявляться три фрагмента: один — исходной длины и два — полученные после рестрикции (рис.! 8.7, а). При наличии делеций в гетерозиготном состоянии наряду с фрагментами нормальной длины будут присутствовать и необычные по размеру (рис.
18.7, б). Выявление полиморфного сайта в гетерозиготном состоянии позволяет отличить мутантный аплсль от нормального, т.е. осуществить его молекулярную маркировку. Однако первичная идентификация полиморфного сайка рестрикции, сцепленного с определенным юном, возможна только при наличии соответствующих ДН К-зондов. ПДРФ-анализ применяют как для прямой (определяют уже известные нуклеотидные замены), так и для косвенной ДН К-диагностики (гл. 19).
Косвенная диагностика проводится по полиморфным точкам, расположенным, как правило, в некодирующих областях либо в третьей букве вырожденного колона, что позволяет различать материнскую и отцовскую хромосомы при семейном анализе в случае гетерозиготности по данному полиморфизму. С другой стороны, такие маркеры являюзся диаллельными, что приводит к невысокой гетерозиготности по данному покусу особей в популяции (не более 50%), что накладывает существенные ограничения на их использование (в связи с их низкой информативностью).
Анализ мини- я мякросателлятиых маркеров, В настоящее время хорошо известно, что в некодирующих областях генома присутствуют так называемые тандемные повторы. Эти повторы представляют собой последовательности, состоящие из различ- ~ пи о количества мономероа Мо~ ~омсры и спело очередь могут содержать от одного и до нескольких десятков нуклеотидогм ')ффскзипность использования мини- и мик- Часть й Общая еенетнка 344 а Нсрмаяьный аялеяь Область делецин l Аялепь с деяецией Сайг рестрикции Тсчкоеая мутация в сайте узнавания ресгриктазы росателлитнь)х последовательностей (маркеров) в ДНК-диагностике обусловлена относительно равномерным распределением их на хромосомах и большим разнообразием. Полиморфизм мини- и микросатсллитных повторов настолько высок, что на хромосомах разного происхождения (мать)гоген), как правило, эти участки содержат разное количество мономеров, (т е.
отличаются по длине), что позволяет различать хромосомы при семейном анализе, прослеживая их передачу в поколениях, и при идентификации принадлежности биологического образца (например, пострадавшийггподозрсваемый). Информативность таких многоаллельных маркеров значительно выше (уровень гетерозиготности достигает 70 — 90%), чем диаллельных (точ ковых замен), а характер расположения полос мин и сателитных ДН К на электрофореграмме («ДНК-отпечаток») индивидуален практически также как и отпечатки пальцев (вероятность идентичности двух индивидов в популяции составляет 10 ' — 1О ~), что позволило дать название методу — геломвая дактилоскопия (йепег(сз Гт— йер оп Гтй).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
