В.И. Иванов - Генетика (1117686), страница 78
Текст из файла (страница 78)
Современные генетические технологии и методы /лава И Йиимики и геиамиые текиалогии 18.1.1,2. ХИМИЧЕСКИЙ СИНТЕЗ ДНК Для научных исследований ДН К пс только выделяют из биологического материала, ~ ю и пол учакп синтетически при использовании ДН К-синтезаторов — приборов для автоматического синтеза ДНК. Принципиальное отличие процесса химическоп~ синтеза от биологического состоит в присоединении кюкдого нового нуклеотида к 5'-гидроксил ьному концу цепи, а не к 3'-концу.
Наиболее распространенным методом химического синтеза ДНК является фос<(юрамндитный (фосфиттриэфирный) метод. Для синтеза используют модифицированные дезоксирибонуклеозиды. Для предотвращения неспецифического взаимодействия 5'-гидроксильной группы первого нуклеотида до добавления в реакцио~п ную смесь второго нуклеотида ее защищают с помощью диметокситритильпой (ДМТ) группы. Каждый последующий присоединяемый к расгушей цепи нуклеогид добавляется в колонку в виде фосфорамидита, те.
содержит ДМТ-групггу и дни юпро- ~ ~ илам инную группу на 3'-фосфитной группе, защищенную метильным остатком. Химический синтез необходим для получения одноцепочечных олигонуююогидов длиной <50 и и. Такие олигонуклеотиды используют для конструирования ~ голых шномов и их фрагментов, в качестве праймеров для амплификации специфических последовательностей и секвенировании ДН К, для сайт-специфнческого мугагспсза 1п уйго, в качестве зондов при гибридизации и в качестве линкеров, облегчающих клонирование, Химический синтез применяют при затруднении клонирования пи~а (если известна аминокислотная последовательность белка). В тех случаях, когда кодоны гена плохо считываются организмом хозяина, можно синтезироватыен с таким набором кодонов (оптимизация кодонов), который сохраняет аминокислотную последовательность прежней, но транскрибируется более эффективно.
Для того чтобы синтезировать ген, необходимо каждую из цепей составляющей его последовательности синтезировать отдельно. При большой протяженности гена его синзезирукп отдельными фрагментами, которые впоследствии «собирают» с помощью ДН К-полимеразы и ДНК-лигазы.
18 1.1.3. АМПЛИФИКАЦИЯ И РЕСТРИКЦИЯ ДНК Все молекулярно-генетические методы основаны на использовании различных классов ферментов, два нз которых имеют наибольшее значение: ДНК-полимсрлзы и рестриктазы (их свойства подробно описаны в гл. 9). Д Н К- пол име разы осуществляют синтез Д Н К, и для их работы необходима о~ и ю цепочечная матричная ДН К с двухцепочечиым участком на 3'-конце молекулы и чс тыре типа дезоксинуклеотидтрифосфатов (б)~ТР: бАТР, ОСТР, дСлТР и гПТР). ДП К ~юлимеразы обладают различными видами активности, в том числе и зкзонуклсаз ной в направлении 3' — > 5', что позволяет этим ферментам репарировать дсфскне образовавшиеся при синтезе Д Н К.
Способность ДН К-пол имеразы 1 Е. си(г' им и пи и ровать репликацию в месте разрьпеа ДН К и замещать гомологичный учаспгк и диой ~юй цепи ДНК используется для введен~ив вДНК меченых нуклеотидов метолом иии траисляции, а также для заполнении б)зсщей при сборке протяженного гена из хи ми 330 Числя й Ол~ции генетики чески синтезированных олигонуклеотидных последовательностей. Основное свой- ствоДНК-полимераз — осуществлятьсинтезДНК вЂ” используют при амплификации изучаемого фрагмента ДНК. Одним из вндов амплификации является полимеразная цепная реакция.
Полнмеразцая цепная реакция (ПЦР). Метод ПЦР был предложен в 1983 г. американским исследователем Кари Муллисом. Суть этого метода заключается в специфической амплификации ДН К с помощью полимеразы, осуществляющей избирательный синтез взаимно комплементарных цепей ДНК, начиная с двух цраймеров (затравок). Праймеры комплементарны противоположным цепям ДНК в участках, ограничивающих выбранную область ДН К, и ориентированы 3'-концами навстречу друг другу и в сторону той последовательности, которую необходимо амплифицировать.
Длина амплифицируемого фрагмента определяется расстоянием между праймерами. Используя в качестве матрицы любые образцы ДНК, содержащие амплифицируемую последовательность, можно увеличить количество копий изучаемого фрагмента ДНК в сотни миллионов раз. Такое увеличение, позволяющее визуализировать заданный фрагмент ДН К на электрофореграмме, а также использовать продукт амплификации для дальнейшего изучения с помощью других методов, можно считать главным достоинством метода П11Р. Основной недостаток этого метода — необходимость знания ДНК-последовательностей, фланкирующих изучаемый ген, ддя создания праймеров. Для проведения специфической амплификацин необходимы: 1) матричная Д Н К мишень (достаточно даже одной молекулы) длиной от 100 до = 35 000 п.нц 2) два искусственно синтезированных праймера — олигонуклеотидные последовательности длиной 15 — 30 п.нд 3) термостабильная ДНК-полимераза (чаще используют ДНК-полимеразу 7легтш ациагГсиз, или Тай), сохраняющая свою активность при температуре 94 'С и выше; 4) четыре дезоксирибонуклеотида.
ПЦР состоит из многократных повторений цикла, состоящего из трех этапов; 1) делатураяии (плавления) двухцепочечных структур — перевод их в одноцепочечную форму путем нагревания до температуры 94 С; 2) ренатураяии или гибридизации (отжига) комплементарных участков ДНК с праймерами при температуре 37 — 68 'С; 3) синтеза последовательности, комплеменгарной матричной ДНК при 72 'С. В первом цикле праймеры гибридизуются с исходной матричной ДНК и образуют так называемые «длинные матрицы», В последующих циклах праймеры спариваются с вновь синтезированными молекулами ДНК, образуя «короткие матрицы» (рис. 18.1). При этом синтез ДНК заканчивается не при изменении температурного режима, а по достижении ДН К-полимеразой границы амплифицированного участка. Скорость синтеза определяется длиной амплифицируемого фрагмента, Как правило, ПЦР включает 25 — 30 циклов, и к последнему циклу в реакционной смеси содержатся практически только «короткие матрицы» (амплифицируемые фрагменты).
ПЦР обычно проводят в автоматическом режиме, используя для этого специальные приборы — термоциклеры или амплификаторы ДНК, позволяющие задавать Глаеи (>к Гемрмикп и геном>тн текпплогин ( цикл и >И цикл ттптгтттттттт1~(>тг Ц.Ц '- ЮЭ> ШШШШШ~Ш Синтезнрующиеся длинные матриць 3' з з'~ г ~ГГТТТТ>ЧТГТТП~йтю иШШШ ШйИЦ з Ц.Ц( — — — — д>~йЧм-з Синтезиру>ощаяся каронак матрищ> гу' Синтезирующиесядлинныематрицы.
>( цк" -;.--.а(щ>(ь' з з~ Длинные матрицы ТТТТТТТТГТТТТТиу и ТТ з ТТТТПТГГГГГ ГГИИ ш( 4 >уф Синтезирующиеся длинные матрицы Синтезирующаяся короткая матрищ Синтез ирующаяся короткая матрица (~': " ' з" "ЩЩ ШДАШШЛВИДЬ..Э-. ' Д инные матриц 5' ' Длинные матрицы ...'"- "-""' ФТТТПТТПТТТТИИ' и тттт ТТТТТГТТТ.
ЧТТТйй(у з ' ( Ц ( б у$ , Ш'( 4 йаищ(з, Синтезирующаяся короткая матриц Синтезирующаяся короткая матрица . Короткая матриод ГГПТТТТТГГ(~ гШ~......)У>к '" ., Синтезирующаяся короткая матри> 3'мф - - -- - з' ~ Ийй Последааательности ДНК, ъ > з г>й(Ч ЬШ:С;,-ц> комппементарные лраймеру Короткая матрица НФ Гибридизующиеся прайыеры Рис. 18.1.
Механизм ПЦР нужное количество циклов н выбирать оптимальные временные и температур> > шраметры для кюкдого этапа цикла. Существует ряд модификаций ПЦР используемых в зависимости от ко»креи »елей проведения реакции или от метода последующего молекулярного впали и илификатов. Одна из широко используемых модификаций П ЦР— метод мультмплеисной а лмфыкаиыы (МПА), позволяющий проводить ПЦР нескольких изучаемых фрам тов в одной пробирке, что не только убыстряет и удешевляет анализ, но и ио ииы рассматривать одни фрагменты, получающиеся в результате МПА, в качестве и< жительного контроля реакции для других.
Добавляя в реакционную смесь мсчс б(к(ТР, можно при необходимости получать меченые продукты П Ц Р. Проведение П ЦР с молекулами кДН К позволяет анализировать экспрессии иов и получать большие количества кДН К. Реакцию амплификации можно проводить непосредственно на хромосом »репаратах и при использовании меченых нуклеотидов визуализировать комилс> тарные продуктам амплификации участки Днк на хромосомах, (метол Рк(~и а> ил. ро(утегозе геае»рп >и в>>и). Су>цествуют варианты ПЦР (ассимстричиая ПЦР— с избытком олио>о из оп ираймеров; ПЦР с использованием мш>щтиых частиц с фиксированным ш> и: нсрхиости стрептавили>юм и би<пи>н>и<>й метки одного нз праймеров), иозио и >не синтезировать и вылел>пь и рс им у и тес пил и ю од но не почечные ф рагмс> ггы >' 332 Чаопь б 0<тя<ая геиеаика что значительна облегчает их секвенирование.
В ряде случаев применяют метод СА»»ТЯ (от англ. хев«те ал<р111)саг<ол <«!г<< ггапз<г<рг зеч««всех) — амплификацию с праимерами, несущими сайт узнавания ддя фермента Т7-РН К-палимеразы, с последующим секвенированием одноцепочечного РНК-транскрипта, полученного из амплификата при помощи Т7-РНК-полимеразы. Продукты П ЦР и любые другие фрагменты ДНК наблюдают в геле после проведения гель-электофореза и специфического окрашивания. При окрашивании геля бромидом этидия и просмотре в проходящем ультрафиолетовом свете месталокализа«ии ДНК выявляются в виде красной полосы. На электрофореграмме можно определять наличие или отсутствие амплифицированного фрагмента в изучаемом образце, обусловленное протяженными делециям и и структурными перестройками, регистрировать изменение его длины.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
