В.И. Иванов - Генетика (1117686), страница 79
Текст из файла (страница 79)
Причинами отклонения в размерах синтезированных молекул могут быть: 1) инсерции или делеции нескольких нуклеотидов в исходной матричной молекуле ДН К, 2) конформационные изменения в одноцепочечных молекулах ДН К, возникающие при замецс оснований, 3) структурные изменения в дуплексах между нормальными и му<нитными вариантами амплифицированных фрагментов ДНК. Таким образом, ПЦР представляет собой не только метод амплификации (синтеза), но и альтернативный метод анализа геномной ДНК.
Однако в некоторых случаях для установления конкрсп <ой причины выявленных на электрофореграмме отклонений в размерах полученных фрагментов Д Н К необходимо дальнейшее изучение продуктов амплификаци и с помощью блот-гибридизации со специфическими олигонуклеотидными зондами, рестрикционного анализа, 88СР и других методов (в зависимости от цели). Рестрикция ДНК. Рестриктазы, или рестрикционные эндонуклеазы, — ферменты, обладающие эндонуклеазной активностью и участвующие в системе распознавания и защиты «свонх» и уничтожения чужеродных ДНК )л гл<». Известно более 500 различных типов рестриктаз бактериального происхождения, каждая из которых узнает свою специфическую последовательность в двухцепочечной молекуле ДНК. Длина распознаваемого участка варьирует от 4 до 12 нуклеотидов.
Обнаружив эту < юследовательность, рестриктаза разрезает молекулу ДН К на фрагменты в местах ее локализации, называемых сайтамирестрикяи«. Чем больше сайтов рестрикции, тем болыне образуется рестрикционных фрагментов. Длина рестрикционных фрагментов зависит от распределения сайтов рестрикции в исходной молекуле ДН К: образующиеся фрагменты тем короче, чем чаще расположены эти сайты.
В зависимости от частоты расположения сайтов рестрикции в молекуле ДН К вьщеляют три класса ресгриктаз: частощепящие — как правило, узнают короткие специфические последовательности длиной в 4 — 5 п.н. (например, Тая)) среднещепящие — узнают средней длины (6 — 7 п.н.) специфические последовательности (например, Есой)); редкощепящие— узнают длинные специфические последовательности в 8 — 12 п.н. (например, ЛЪг/). Сайты рестрикции часто используют в качестве генетических маркеров ДН К„так как образующиеся в результате рестрикции фрагменты ДНК могут быль упорядочены по да и «е путем злектрофореза в агарозном или пол иакриламидном геле в зависимости от их молекулярной массы.
Зная молекулярную массу фрагментов, можно определить физическое расспзяние между сайтом рестрикции и концами исходного фрагмента ДНК, что »и<ляется осно<юй метода, получившего название физического картвровавия (рис. 18.2). ззз Рлиии гЕ. ггнпмики и гюл нные гнекнплогнн и Есо В) Висл и) Виги Н>Есо В) 900 ВОО 700 б50 600 500 400 350 200 1ОО Есо В) или бОО 350 350 Ваги Н) 900 б50 или 900 б50 1ОО Ваги ННЕсо В( 350 200 400 500 Рис. 18.2. Картированис сайтов рестрикции а — результаты злактрофоретического разделения фРагментов днк, полученных в результате рестрикции (м — маркер молекулярной массы; есоп), Вагон) — Рестриктазы; Ваптн)чесоп)— смесь рвстриктаз). б — рестрикционная карта, построенная на основе определения длины фрагментов (п н ), которая соответствует расстоянию мвхгду свйтами узнавания рвстриктаз.
При обработке тотальной гено мной эукариатической ДНК, например ДН К человека, часто- или среднещепящими эндонуклеазами обРазуется огромное количество фрагментов различной длины (в среднем порядка 1 млн). Раэделить эти фрагме) сгы с помощью электрофореза и визуально идентифицировать каждый из них невозможно: на электрофореграмме видна полоса, равномерно окрашенная по всей длнос юля, — шлгер.
Обнаружение определенных фрагментов рестрицированной геномпой ДНК на электрофореграмме возможно только путем гибридизации с мечеными ДН К-зондами. 18.1.2. МЕТОДЫ ПОИСКА, ВЫДЕЛЕНИЯ И ИДЕНТИФИКАЦИИ ОПРЕДЕЛЕННЫХ УЧАСТКОВ ДНК Длительное время, до разработки ПЦР, единственными методами обнаружения и выделения специфических фрагментов ДН К (геномных и кДН К) с целью их последуюьцего изучения были гибридизация с ДНК-зондами и клонирование, несмотря ЗЭ4 Чигии Г Гддиии,юн клики на целый рнд ограничений их применения. К оаннинам ограничениям относятся следующие: большой размер исследуемых фрагмс поп, з1 гачительно превосходящий длину ДН К-зондов и препятствующий прямому молекулярному анализу; невозможность произвольного выбора концов изучаемых последовательностей, определяюгнихся наличием соответствующих сайтов рестрикции в исходной молекуле ДНК; ~необходимость большого количества хорошо очищенной высокомолекулярной геномной ДН К (не менее 10 мкг на одну реакцию, по равноценно 0,5 — 1 мл крови), для и;номной гибридизации — наличие радиоактивных ДНК-зондов с высокой удельной акгивносп ю не менее 10~ импДмин мкг), действующих ограниченный промежуток времени, и специально оборудованного изотопного блока.
К тому же длительная экспозиция автографов значительно удлиняет время получения результатов. Все это, а также большая трудоемкость исследований, о гранич ива кп испол ьзование методов блот-гибридизации и клонирования для пренатальной диагностики плода (ответ в этом случае надо получить быстро) и дйагностикн наследственного заболевания при гибели больного в этом случае невозможно получить большое количество Д Н К). Однако эти методы не потеряли своей актуальности и используются для картирования и изучения новых генов. 18.1.2 1. ГИБРИДИЗАЦИЯ С ДНК-ЗОНДАМИ ДН К-зонд — одноцепочечная ДНК, длиной до 30 нуклеотидов, используемая для !виска комплеменгарных последовательностей в молекуле большего размера или среди множества разнообразных молекул ДН К. ДНК-зонды можно синтезировать искусственно либо вьщелить из генома. Затем эти последовательности клонируют, чтобы имегыюзможность получать их в любое время и в неограниченном количестве.
Блот-гибридизация. Это высоко чувствительный метод идентификации специфических последовательностей ДНК. Денатурированные фрагметы ДН К переносят на !цютный носитель — нитроцеллюлозный фильтр или нейлоновую мембрану. Далее фиксированную на этом носителе ДНК гибридизуют с радиоактивно меченным ДН К- или РНК-зондом. Затем положение искомого фрагмента геномной ДНК на электрофореграмме определяют методом радиоавтографии. При длительной экспозиции (в течение нескольких дней) и при высокой удельной радиоактивности ДНК- зонда (более 10~ распДмин мкг)) этот метод позволяет выявлять менее чем 0,1 пг ДН К.
Этапы блот-гибридизации схематически представлены на рис. 18.3. В зависимости от типа изучаемого вещества, способов его предварительной обработки и переноса (блотгинга) различают несколько разновидностей этого метода. Саузери-блот, или блот-гибридизация по Саузерну — наиболее эффективный метод идентификации определенных молекул ДНК среди электрофорегически ра:.Деленных фрагментов, предложенный в 1975 г. Эдвардом Саузерном.
Геномную ДН К обрабатывают одной или несколькими рестриктазами и образовавшиеся фрагменты разделяют по относительной молекулярной массе в агарозном или акриламидном геле. Далее фрагменты ДНК подвергают денатурации 1п в!го и переносят с геля на плотный носитель. В данном случае блоттинг (перенос) осуществляется за счет действия капиллярных сил, электрического поля или вакуума.
/лини И П кн1мнки и ггннмниг михннлилин Првсс 0 Слой Филироввльной бумаги Фиксирующий рлз 0 б лг Рис. 18.3. Методика блот-гибридизации. (Из: В.Н. Горбунова, В.С. Баранов, 1997) в — боот-гибридизвция по Саузерну; б — дот-гибридиеация; в — слот-гибридизвция. Методы дот- и слог-гибридизации получили свои названия в зависимости от <)хкрмы анализируемого пятна ДНК на фильтре — округлой или продолговатой, соответственно. На твердую матрицу препараты ДНК и РНК наносятся капельно. Принципиальное отличие этих методов в том, что с меченым ДНК-зондом гибридизук>гся молекулы Д Н К или РНК без предварительной обработки рестриктазами и электрок1юреза. нозсрн-блот ()чог(йегп-ыос) — метод гибридизации Дн к-зондов с электрофорс тически разделенными молекулами РНК.
Всстери-блот (Члса(егп-Ыо<), или и ммуноблот, — это связывание электрофоретичсски разделенных белков, фиксированных на фильтрах, с мечеными антителами. ззь Чигть Х 06млн,глетихи 11апгапия двух последних методов обра кланы по аналогии с Саузерн-блот (Зоийггл-Ыиг). Их можно рассматривать как дань уважения сообщества молекулярных генетиков Эдварду Саузерну, внесшему неоценимый вклад в разработку методов, используемых для анали- за ДНК. Перечисленные виды блот-гибридизациии имеют ряд недостатков: необходимость использования хорошо очищенных препаратов ДНК н радиоактивных зондов, длительность и трудоемкость процедуры.
Все это делает данные метоРис. 18.4. Кариотип больного с репи- ды весьма дорогостоящими. Тем не мепРокной тпанслокацией 12Р;!4г1 пРи ис- нее, блот-гибридизация не утратиласвопользовании мультиплексной Р1ЯН. (Из: Т. Р Ое1е) ег Е8С0111ж Ра) Ь, 1998) ег. Зн'че "Я в на ° ее ВРе Ис- пользование различных вариантов нерадиоактивного мече пня (биотнн- или флуоресцеин-меченные ДНК-зонлы) или окраски ДНК нитратом серебра позволяет применять этот метод для диагностики генных болезней. Гибридизация ш зйв. Метод гггбрнлизации с ДНК-зондами на гистологических илн хромосомных препаратах (т.е.
метод гибридизации, не требующий предварительного выделения и очистки ДНК). В настоящее время наиболее широко используется Р1бн (от англ. )1 иогезселг гл згги йубп уйайоп) — вариант метода, при котором в качестве зондов используют препараты ДН К нли РНК, меченные флуорохромами. Меченый ДНК-зонд наносят на препараты дифференциально окрашенных и подготовленных для гибридизации (денатурированных) метафазных хромосом. После удаления не связавшихся молекул ДНК и специфической обработки, в зависимости от типа использованного зонда, места хромосомной локализации последовательностей ДНК, комплементарных соответствующим ДНК-зондам, наблюдают в микроскоп в виде характерных светящихся точек (рис.
18.4). Гибридизация ш ягп — один из наиболее эффективных методов картиравания комплементарных ДНК-зонду последовательностей ДНК на хромосомах. Его применяют при исследовании распределения по геному повторяющихся последовательностей ДН К, клони рованных последовательностей ДНК анонимного происхождения; при определении хромосомной принадлежности и внутрихромосо мной локализации уникальных генов, взаиморасположения клоннрованных фрагментов ДНК даже в пределах одного хромосомного локуса. Разрешающая способность Р1ЯН-метода достигает нескольких хромосо иных бэппов: при проведении гибридизации ш ягп на интерфазных (растянутых) хромосомах человека она может достигать 50 т пн., что составляет около 5% величины среднего хромосомного бэнда.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
