В.И. Иванов - Генетика (1117686), страница 80
Текст из файла (страница 80)
Гибридизация ш ящ молекул РН К с кДН К-зондами, проводимая на гистологических препаратах, эффективно используется для анализа тканеспецифического распределения и внутриклеточной локализации мРНК. Гливи И Геяомнки и геномнме нтекноммнтт 18Л.2.2. КЛОНИРОВАНИЕ' ВЕКТОРНЫЕ СИСТЕМЫ И МЕТОДЫ. СОЗДАНИЕ И СКРИНИНГ БИБЛИОТЕК ГЕНОВ Клонирование — один из методов выделения и идентификации фрагментов дН К, а также гюлучения их в неограниченном количестве.
Выделенные и идентифициронннные фрагменты могут быть использованы для молекулярного анализа, в качестве дН К-зондов и для создания библиотек генов. Метод бьи разработан на бактериях и свое название получил из-за того, что все производные одной бактериальной коло- ~ ~ни содеРжат идентичные фРагменты ДНК, те. пРедставлЯют собой клоны, Клонирование фрагмента ДНК включает несколько последовательных этапон (рис. ! 8. 5): ! ) встраивание клонируемого (чужеродного) фрагмента дНК в векторную молекулу ДН К (образование химерной молекулы — рекомбинантной дНК В 2) проникновение этой конструкции в бактериальную клетку хозяина.
3) идентификациЯ клеток, содеРжащих Рекомбинантную ДНК и их отбор (к гк правило, осуществляется на селективной среде); 4) получение необходимого количества клеток, содержащих рекомбинантную Д Н К (собственно клонирование). При необходимости индуцируют экспрессию клот ~ ирова н ного гена в клеткзм-хозяевах и попутают копируемый им белок Итак, клонирование предполагает встраивание (инсерцию) экзогениой дНК л векторную молекулу ДН К.
Векторные системы, обеспечивающие доставку чужеродного фрагмента дНК в клетку хозяина, для прокариот и эукариот различны. для клонирования в прокариотических клетках используют плазмиды, фаги и космиды. В зависимости от типа векторной системы, используемой для доставки клонируемого фрагмента ДНК, процесс переноса генов носит название: при использовании плазмиды — трансформации; при использовании фага — трансвукнин, Перенос зкгкт- Клонируемвя последовательность Литирование Клетке.хозяин Рестрикция Донорнвя ДИК Лиивдоизвция Хлонирующий вектор (плвзмипв) Рис. 18.8.
Этапы клонирования фрагмента дНК с использованием плазмидиого вектор 33Н Чаегк» й Общие и иеккики ни ~ ной ДН К н зукариигические клетки назывная трансфекцней. В качестве векторов цнн переноса ДНК в эукариотическис клетки ис~юльзукгт дрожжевые плазмицы (спи~ ктве нные плазм иды, найденные в эукариотических клетках) и различные эукариотичсские вирусы (чаще всего ретровирусы, аденовирусы или аденоассоциированпыс вирусы). В ряде случаев введение векторных конструкций в эукариотические клетки осуществляютпугсм ко-гнранеформацин — оцновременного введения плазмицы и сегмента чужероцной ДН К.
В клетках эукариот векторные конструкции сохра|ьчются н вице эписом (суперскрученных кольцевых молекул) в течение нескольких дней, а иногда экзогенная ДНК интегрируе гся в хромосомную ДНК и устойчиво сохраняется в геноме клетки-хозяина. Конструирование клонирующих векторов гюдразумевает встраивание или удале~ ние уцобных для идентификации клонов генетических элементов (специфических снйтов рестрикции, инициации и регуляции транскрипции), Например, при создании плазмидных клонируюших векторов ослабляют систему контроля репликации и цоб нщяют или вырезают гены антибиотикоустойчивости, При формировании фагоной векторной конструкции экзогенную ДНК встраивают в район локализации маркс(вино гена, позволяющего вести селекцию химерных фатов по экспрессии химер~кпо белка (часть полипептидной цепи соответствует маркерному белку, а часть— и~ я)хгрмации, заключенной во встроенном фрагменте ДН К).
Определение химерно- ~ о белка возможно при использовании антител к фрагменту маркерного белка или у щетку, коцируемому чужероцной ДН К, а также путем выявления функпионально нкгинно~о белка после протеолитического расщепления химерного полипептида. ((ри конструировании искусственных дрожжевых хромосом гАС (от англ. уеазг аггГ- /и кй ел отозогнее) используют плазм идные векторы, соцержашие в своем составе изнссп ~ ые центро мерные и теломерные п ослецовательносги хромосом црожжей, необходимые для поддержания репликации векторов в клетках хозяина, Характеристики клон ирующих векторов прецставлены в табл. 18.2. Некоторое время идентификапия нужных геномных клонов проводилась очень трудоемкими методами — «прогулки» и «прыжков по хромосоме». Их этапы схематически прсцстанлены на рис.
! 8.6. «Прогулка по хромосоме», или скользящее зондирование, заключается в послецователыюм отборе клонов, несущих перекрывающиеся в концевых участках фрагменты ДП К из определенной области генома. Выделив клоны, например, путем скрининга библиотеки с помощью маркерной ДНК, сцепленной с нужным геном, их используют н качсстнс ДНК-зондов для поиска других клонов с перекрывающимися последоваи ныюстями. В результатеполучаютнаборфрагментов, полностью перекрывающихоблас гь поиска гена, — конпшги.
С помощью метсдов физического картирования устаивал инаюг размер перекрывающихся участков (в п.н.) и строят физическую карту данной области. Несмотря на то, что прогулку можно осуществлять в цвух направлениях, при использовании рестрикционной карты, эффективность этого метода мала. При использовании космидных библиотек каждый шаг зондирования в одном направлении раню ~ 20 то.и. (0,02Мб), а из-за наличия в геноме повторяющихся и трудно клонируемых последовательностей можно пройти около 200 — 300 т.п.н. (0,2 — 0,3 Мб). Метод клонирования способом «прыжков но хромосоме» позволяет идентифицировать участки, отстоящие друг от цруга на сотни тысяч нуклеотидов, не выделяя Глана 18. Генамиха и генимил<е нзехнтаеиз< рволняа 18.2. Характеристика клоннрунмянк некгорон Прнменеане Размер кззоонрр- емык нстааок, н.н.
Длина ДНК лектора, а.н. Примеры Вектор цо 5 х 10з от10' Создание библиотек кДНК Клонировшяе „асуп ных фрагментов Создание геномных н кДНК-библиотек Создание геномных библиотек РВВ322, Со)Е! Е-плазмила ы 1, Плазмиды х 2. Фаги Р й 3. Космиды й цо >5 х 1О' 1,5-3 х 1О' <2 х 104 5 — 10х 1Оз <йх 104 Л-ЛВ< 1О,ЛВ<11, Ле.ар, р1 ЕК-5 >10' — 10е КлОниРОВание субхромсесмных фрагмептов ДНК, содержащих целые тень Создание геномных блиотек 1.
Дрожжевые- минихромосомы (УАС) В 2. Вирусы ретровирусы е аденовирусы аденоассоциированные Негрез еунзр1ех 8 т.п.н. 8 т.п.и. 2 — 5 т.п.н Генотерапия 30т.п.н. 152 т.п.н. о ьность. ДлЯ созданиа библиотеки 'снов опрыжковпохромосоме»проводятрестрикциюгеномнойдНКредкощепящей рестриктазой (как правило, наиболее удобен фермент, сайты рестрикции которого находятся на расстоянии примерно 200 т пи. — длина прыжка), Эти фрагменты сшивают с небольшим маркерным геном, как правило с геном еирГ (длина =7 т.п.н.) фага Л, что приводит к циклизации фрагмента.
В результате этого концевые участки, исходно находившиеся на расстоянии несколько сотен т.п.н. уцалены друг от цруга лишь на длину маркерного тена. Обработав кольцевые молекулы среднещепящей рестриктазой (наиболее часто используют Ееой 1), отбирают фрагменты длиной примерно 20 т.п.н., среди которых и содержащие маркерный ген и фланкирующие его послецовательности. При встраивании в вектоР амплифицироваться в клетках-хозяевах отрицательных по маркерному гену буцут только последовательности, содержащие этот ген, Далее идентифицируют клон метоцом гибридизации с ДНК-зондом, специфичным для исхоцной послецовательности. При последующем субклонировании в плазмидном векторе получают цва субклона. Один субклон гибрицизуется с ДН К- зондом, специфичным для исхоцной послецовательности, второй — ие гибрицизуется с этим дНК-зондом и содержит фрагмент ДНК, отстоящий от начала исходной молекулы на длину прыжка.
После создания геномных библиотек, содержащих большие фрагменты ДН К, и построения карт контиг метоцы сиро<улки» н епрьокков по хромосоме» утратили свою актуал ыкють. Библиотеки генов и их скрииииг. На основе тсхнологии клонирования, поз<юляющей обнаруживать определенный фрагмент ДН К и получать его в необходим<зм ко- Чигщь 7. Общо» гг'»щ»и»а Исходная молекула ДНК 1.
! ! ! ! "; Субююн Я' ~ 40тп,н. ~=4БЕ) 6(Евка(ЕЕ) 6ЕДР =МЫ от последозательности 1 до последоаательности 5 Субюган Я, ~ Ф Ю - ДНК-зонды = — клоны «прап(печной» библнатеки Геномнзя ДНК Рестрикция и ( Выделение фрагментов длиной 200 т.п.н. Л В М У (ч( 'тг тйг :звгвк Лс упзуЮЮВВ М ЛигнровегнесгеммкирР, 7тд.н.
(~) Х 'тт«я(яяГЕВ тйт Цяклхзацня у Обработка Есо ЯГ (чйаЮ~ЕЯ М йтййг~Юаата тт Кпонирозанне з «азкгоре В~А юазй к::==3 кзе и НК фага Л СкрннированиесДНК-зондом уГ' Субоюнирование ~тц а плазмиде — — Плазмиаа Рис. 18.6. Принципиальная схема методов клонирования путем «прогулкия (а) и «прыжков» (б) по хромосоме а — для создания каждого последующего зонда гибридизоеаашуюся поспедоеательность суб- клонируют и строят ее рестрикционную карту.
С помощью созданного зонда выбирают следу- ющую последовательность. В резул~тате получают ряд перекрывающихся последовательно- стей общей длиной 40 т.п.н .х п, исключая перекрывающийся участок между ними (зонд). Че- тыре таких фрагмента охеатыаают примерно 1бо п.н. б — см объяснение е тексте. Гла«а 1«'. Ггнамика и генамнме технала,ън з«ю пичестве, сконструированы библиотеки ~снов, служащие исто шиком различных фрагме~ нов ДН К.
Библиотека гевов — это ~ ивп ~ый набор клони рованн ых перс кры вакппихся ДН К-фрагментов, которые получспы в результате рестрикции или механического разрезания исходноИ молекулы ДН К, выделенной из какого-либо биологического материала (тканей, культур клеток, отцельноИ хромосомы или из ее фрагментов). Количество различных клонов, или информационная емкость библиотеки, зависит от размера исхоцной ДНК (генома) и обязательности присугствия каждого фрагмента хотя бы в одном клоне. ОптимальныИ размер перекрывающихся фрагментов для клонирования при создании библиотеки генов цолжен соответствовать срецнему размеру гена того вида или типа живых организмов (для млекопитающих— 15 — 25 т.п.н.), для которого она создается. Библиотека может содержать всю геномную ДНК цанного вида (экзоны, интроны и межгенные участки) или только коцирующие последовательности.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
