В.И. Иванов - Генетика (1117686), страница 83
Текст из файла (страница 83)
ВВСР-анализ — наиболее часто используемый метод для выявления точковых замен внутри фрагмента ДНК (как правило, размером от 50 до 300 п.н.), полученного в результате ПЦР. Этот метод, предложенный в 1989 году, чрезвычайно эффективен, так как основан на регистрации различий электрофоретической подвижности одноцепочечной ДНК исследуемого и контрольного образцов одинаковых по длине, но различающихся по нуклеотидному составу (см.
рис. 18.9, а). Различие в нуклеотидной последовательности обусловливает разницу вторичной конформации одноцепочечных фрагментов, образующихся прн денатурации (химической или температурной). Именно от вторичной конформации зависит электрофоретическая подвижность молекул ДНК в полиакриламндном геле. На процесс конформации также влияют различные внешние факторы: температура, концентрация акриламида и глицерина в геле, ионная сила буферных растворов.
Эффективность выявления мутаций этим методом существенно зависит от размера анализируемого фрагмента; при его длине менее 200 п.н. она составляет 80 — 95% а при размере более 400 п,н. — около50%. После обнаружения фрагмента с измененной электрофоретической подвижностью, как правило, проводится секвенирование первичной последовательности ДН К мутантного фрагмента для определения конкретной нуклеотидной замены.
Гетеродуилексцмй анализ (НА — от англ. Ьегепх(ир1ех аиа(уз1з). Метод НА позволяет идентифицировать мутации, находящиеся в компаунде (мутации в пзмологичных генах различные по молекулярной природе и внутригенной локализации) или в гетерозиготном состоянии, Метод основан на выявлении различий электрофоретической подвижности гомодуплексов и гетеродуплексов, полученных при ПЦР (см.
рис. 18.9, б). При амплификации небольших фрагментов генов гетерозигот н гомознготных компаундов образуются три типа молекул ДНК: два типа гомодуплексов— из двух нормальных и из двух музантных цепей, и молекулы, несущие мутацию лишь в одной из цепей (гетеродуилексы). Отличие электрофоретической подвижности гетсродуплексных молекул ДНК от обоих типов гомодуплексов обусловлено конформационными особенностями вследствие наличия мест несовпадения нуклеотидов. Вероятность идентификации точковых мутаций методом НА прн длине фрагментов ДИК 4300 п.н.
составляет 90 — 98%. Депатурирующпй градиентный гель-злектрпфорез (АТОСŠ— от англ. г(епагигаг(оп етаг(1глг хе1 е(есиорйогщ1з). Метод ОООŠ— основан на различиях в условиях и характере денатурации нормальных и мутантных двухце почечных фрагментов ДНК, льппщяемых путем сравнения их электрофоретнческой подвижности в пол накриламидном геле с линейно возрастающим градиентом концентраций денатурирующих агентов (мочевнны и формальдегида) (см.
рис, 18.9, в) . Скоростьденатурации (или плавления) зависит от соотношения А — Т/Π— С пар в исследуемых 349 Глава И гетггмгика и ееиомиые лчехиолоеии Лкк "Л«к ю Гомодуплексы Различия конформационной структуры одноцепоичюйДНК Гетеродуппексы ия прн плавлении Низкая концентрация денатурирующего агента Высокзя концентрация дензтурирующего агента 0 ПЦР, получение Модифнцирозанне химическим агентом неспаренныхосноеаний Гомодуплексы Расщепление Гетеродуплексы йшгнорезмерная проба Продукт расщепления узис. 18.9. Принципы и резулътгнй ндентзтфнкацнн точковык мутаций различными методами (По: В.Н. Горбунова, В.С. Баранов, 1997) а — ЕЕСР-анализ, б — НЯ-метод; в — 066Е-метод, г) СМС-метод Дорожка 1 — образец ДНК нормальной гомозиготы; дорожка 2 — образец ДНК гетерозиготы ло точковой мутации; дорожка 3 — образец ДНК гомозиготы ло точковой мутации. зло Часть /. Общин еекеглика фрагментах (Сз — С-саязь более устойчива).
При известной нуклеотидной послсдоващльности для подбора условий плавления или определения скорости денатурации нри выбранном ~радиенте концентрации применяют специальную компьютерную про~рамму. Плааление даухцепочечных фрагментои ДНК происходит и строго специфичной для данной последовательности области, эквивалентной температуре нлщщсния (температура, при которой каждая пара оснований с 50%-ой вероятностью может соединиться или разойтись), После начала плавления продвижение лаухцепочечного фрагмента ДНК и геле резко замедляется, вследствие изменения пространственной конфигурации молекулы, до момента полной денатурации.
Скорость дальнейшего продвижения денатурированных фрагментов ДНК зависит ог их нуклеотидного состава. Для предотвращения денатурации концов молекул ДНК до достижения оптимальной области плавления (обусловлено определенным нуклеотидным составом фрагмента ДНК), к концам молекул ДНК присоединяЮт так называемые зажимы (синтетические фрагменты из СС-нуклеотидоа размером и несколько десятков ~гак). Использование СС-зажимов позволяет выявить асе мутации, локализованные вблизи концов амплифицироаанных участков ДНК, и при длине цепи до 600 п.н.
ьффсктинность выявления мутаций методом 1)ССЕдостигает 95%. К достоинствам этого метода, отличающим его от ллСР и НА, следует отнести ио ~мож~юсть его использования для анализа крупных амплифицироианных фраг- мс~ ггоо ДН К и высокую чувствительность (позволяет улавливать точкоаые мутации, ио и ~икшие даже а одной из 100 обработанных мутагеном клеток, что используется нрп щялизе индуцироианных мутаций). Чаще всего 1)ОСЕ применяют для скринвни мутаций а амплифицироаанных экзонах, при этом в качестве матрицы используют геномную ДНК. К недостаткам метода, ограничивающим его широкое ~ ~рименение и диагностике наследственных заболеваний следует отнести техническую сложность получения равномерного градиента концентрации денатурирующе- ~ о агента а пол иакриламидном геле и высокую стоимость искусственно синтезированных СС-концов. Химическое расщепление иекомилемеитариых сайтов (СМ С вЂ” от англ.
слет(са( титгисб с(еагаее). Метод СМС основан на способности ряда химических агентов специфически разрывать цепь ДНК в месте локализации неспаренного основания: например, цитозин чувствителен к действию гидроксиламина, тимин — к действию осмия тетраоксида, а тимин и гуанин — к карбодиимиду. Тестируемые образцы ДНК (или РНК) смешивают с образцом радиоактииномеченного ДНК-зонда и создают условия для образования дуплексов (нагреиание с целью полной денатурации и последующее охлаждение). При наличии мутации а тестируемых молекулах образуются гетеродуплексы с участками негомологичного спаривания, что и является мише~ п ю для специфического химического агента. Последующая обработка пипериди~ юм приводит к полному разрыву молекулы ДНК а данной точке и образоааниюдвух коротких фрагментов, обнаруживаемых при электрофорезе (рис.
18.9, г) и последующей радиоаатографии. При определении длины каждого фрагмента не составляет зруда установить локализацию мутации. Эффективность выявления мутаций методом СМС при использовании радиоактивно меченных ДНК-зондои составляет 95 — 100%. бтиа И )йвмиии и геиимиие техиилиеии Метод СМС пригоден лля тости)хиип~ин протяженных участков ДНК вЂ” до 2 '~. и. и.. Кроме того, с помои цгю этого метода можно одновременно выяаить и локализонап как несколько одинаковых мушций, так и разных (при использовании нескольких ДН К-зондов — мультиплека|ый вариант метода) в одном фрагменте ДН К, что можно отнести к огромным преимущестнам метода.
Основной недостаток метода СМС вЂ” высокая токсичность используемых химических агентов (карболиимил менее токсичен). Методу родстненен метод расщепления гетеродуплексов РНКазой А: гегеролу| ы лексы в этом случае образованы тестируемой ДНК и комплементарной ей радиоактивно меченной РНК-пробой, аРНКазаАразрезаетмслекулуРНКвместах нарушения спаривания оснований.
Однако с помощью этого метода можно выявить лини, около 50% точковых мутаций. 18Л.З.З. ДРУГИЕ МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ МУТАЦИЙ Для первичной идентификации мутаций можно испсльзолать и анализ аминокислотной последовательности продукта гена. Этот метод целесообразно применять щш выявления редких (не мажорных) мутаций в протяженных генах с большим числом экзонов (ген миопатии Дюшенна, ген нейрофиброматоза 1).
Метод включает выделение тотальной мРН К из лейкоцитов крови, обратную транскрипцию, амплификацию специфических экзонов кДНК, встраивание амплифицированной области ДН К в экспрессирующую систему и анализ образовавшегося продукта (выявление преципитации с антителами к домену белка). 18Л,З.4. СЕКВЕНИРОВАНИЕ Секвениронание — последний этап молекулярного анализа предварительно отобранногоо, клониронанного и протестированного более простыми методами фрагмсцза ДНК. Секвенирование представляет собой определение нуклеотидной послслоиательносги фрагментаДНК путем получения серии комплементарных молекул ДН К, различающихся по длине на одно основание. Существует два основных метода секвениронания: метод Максима-Гилберта (основан на химическом расщеплении ДНК по одному основанию) и метод Сантера (дидезокси-метод). Метод Сантера более надежен и прост в исполнении, и на практике его используют чаще.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
