Н.С. Зефиров - Химическая энциклопедия, том 1 (1110090), страница 150
Текст из файла (страница 150)
При его взаимод. с циклич. имидом ангидроаспартилглнцина, спонтанно образующегося из аспарагииилглнцина, в щелочной среде происходит расщепление пептидной цепи с образованием смеси он б-аспартилгидроксаматовт аспарагиновой к-ты), а также химотрипсин и термолизии. Последние ферменты обладают более широкой специфичностью. Химотрипсин катализирует гидролиз пептидных связей, образованных карбоксильными группами ароматич. аминокислот-тирозина, фенилаланина и триптофана. С меньшей скоростью гидролизуются связи лейцина, метиоиина и гистндина. Термолизин преим, расщепляет связи, образованные аминогруппой остатков с гидрофобной боковой цепью (изолейцин, лейцин, валин, феннлаланин, тирозии, триптофан) Из химических методов расщепления Б.
наиболее специфичный и чаще всего бромциаиовое расщепление по остаткам ход 90-)00%)т ХН 0 ! СН -СН Я ~: — ХН вЂ” СН-СО— о Н -)ч н — он — с 1 ни,гти ,,О О ! ~Х-СН2 — С-— Снр-С"' ' ОН- жо 477 478 де их дансильных производных. Достоинство методаего высокая чувствительность. Для непосредственного анализа первичной структуры Б.
обычно используют секвенатор-прибор, к-рый с высокой эффективностью осуществляет последовательное автоматнч. отщепление Х-концевых аминокислотных остатков путем деградации Б. по методу Эдмана. Все рнии проводятся в цилиндрнч. стеклянном стаканчике, вращающемся с постоянной скоростью в атмосфере инертного газа (рнс. 4). Образец Б. распределяется на стенках стаканчика в виде тонкой пленки. Оптимизация процесса н тщательная очистка используемых реагентов и растворителей позволили поднять общий выход реакции до 95% и выше. Наилучшие объекты для секвенатора-Б.
и пептнды, содержащие в своем составе от 60 до 200 аминокислотных остатков; для таких соединений обычно удастся определять последовательность 30-35 (в ряде случаев 40-50) остатков. Для анализа коротких массу (> )00000); Ряд этих проблем решен благодаря разработке быстрых и эффективных методов анализа иуклеотидной последователъности ДНК. Поскольку первичная структура любого Б.
закодирована в нуклеотидной последовательности соответствующего ей участка ДНК то определение последней позволяет с помощью генетич. кода автоматически устанавливать и соответствующую аминокиелотную последовательность. При этом оказалось особенно эффективным параллельное изучение первичных структур Б и ДНК. Такой подход резко ускоряет проведение исследований и значительно повышает достоверность результатов. Методы взучення пространственной структуры. При изучении пространств. структуры Б. существует два принципиальных подхода: исследование в р.ре и в кристаллич. состоянии. Осн. метод, дающий непосредственную информацию о пространств расположении атомов в молекуле Б,,-рентгеноструктурный анализ.
Он применим только для хорошо кристаллизуюшихся Б. При этом наряду с кристаллом нативного Б. необходимо получать производные, содержащие тяжелые атомы, к-рые были бы изоморфными исходному Б., т.е. давали бы подобные кристаллич. сгруктуры. Тяжелый атом вводится в молекулу Б. при «вымачивании» кристалла в соответствующем р.ре или в процессе кристаллизации. Иногда используют хим модификацию Б., напр. л-хлормеркурнйбензоатом по ЯН-группам. Интерпретация карт электронной плотности молекулы значительно облегчается прн знании аминокислотной последовательности.
Однако далеко не каждый Б. удается получить в кристаллич. состоянии. Необходимое условие кристаллизации-сохранение нативной конформации, к-рая часто реализуется лишь в условиях, приближенных к физиологическим. В частности, Б., входящие в состав нуклеопротешщых комплексов (рибосома, вирусы), хорошо кристаллизуются только в составе таких комплексоа С помощью обычного рентгеновского излучения проводить анализ таких гигантских образований сложно. В этих случаях используют синхротронное рентгеновское излучение, интенсивность к-рого может быть на два порядка выше.
Вследствие этого резко сокращается время эксперимента по регистрации лифракц. отражений, а также снижается кол-во исследуемого в-ва. Ряд мембранных Б. кристаллизуется в условиях нативного лнпидного окружения с образованием т. наз. «двухмерных» кристаллов, представляющих из себя регулярно упакованные молекулы Б. в бислойной липидной мембране.
При изучении двухмерных кристаллов используют электронную микроскопию н электронографню. Во мн. случаях хорошие результаты получают, применяя нейтронографию. Нейтроны, имея низкую энергию, в отличие от рентгеновских лучей ие разрушают кристаллы Б., в результате чего можно получить полный набор дифракц. данных от одного кристалла С использованием этого метола удается локализовать в структуре Б. отдельные атомы водорода, а также расположение молекул кристаллизац. воды. В общем случае конформация пептидов более эффективен подход, заключающийся в их ковалентном присоединении к нерастворимому носителго, Этот принцип положен в основу твердофазного сек авиатора, гле реахц. «сосудом» служит хроматографнч. колонка, с носителем к-рой ковалентно связан исследуемый пептнд.
Через колонку последовательно пропускают реагенты и р-рители. Носителями чаше всего служат полистирол и пористое стекло. В кач-ве фуикц. группы, реагирующей с пептцлом, обычно используется алифатич. или ароматич. аминогрулпа Для присоединения к носителю пептидов, образующихся в результате бромциаиового расщепления, используют высокую резки способносгь С-концевого лактона гомосернна. Лизин«олег» жашне пептиды м. б. присоединены за счет е-аминогруппы путем конденсации с н-фенилендинзотноцианатом. Остальные пептилы присоединяют по С-концевой карбоксильной группе карбодиимидным методом.
Третье поколение приборов-газофазные секвенаторы, в к-рых образец наносится на небольшой (диаметр ок. 5 мм) диск из пористого стеклянного волокна, а все реагенты подаются в газовой фазе. Таким способом анализируют микроколичество в-ва ( «100 пкмоль). При определении аминокислотной последовательности пептидов находит применение также масс-спектрометрия.
В этом случае используется способность ионизнров, молекул пептидов распадаться по т. наз. амннокислотному типу рагментацин, заключающемуся в разрыве СΠ— ХН нлн — СО связей: Ри«4 с«»ча г»«»« квч«рн с»гм»аюе« 4»-~ 4» ! 1 ! ) й»-~ ~ ~ Я» ! ! ! — НН вЂ” СН вЂ” СΠ— ХН-СН вЂ” СО-ОСНз 1 ! ! А~ Аг 3 а~ ) аг г ! ~ ! Я, ~ ! йг ( ! ВСΠ— )ЧН-СН-СО-НН-СН-СО-' ! 1 Б; в кристалле может отличаться (обычно весьма незначительно) от конформации в р-ре. Поэтому наряду с исследованием кристаллов проводят изучение Б. н в его прир среде.
Существует набор методов исследования пространств. структуры Б, в р-ре. Нанб. часто исполь- Илентнфикация в масс-спектре пиков, соответствующих фрагментам А, ... А„или а, ... а„, дает информацию о строении пептида Наиб. сложные проблемы возникают прн изучении пер. алчной сгруьтуры мембранных Б., а также Б., выделяемых в ничтожно малых кол-вах или имеющих большую мол.
479 эуемые — оптич. методы (УФ-, ИК- н Раман-спектроскопия, кру~овой днхроизм, флуоресценпия), ЯМР н ЭПР. Ни одним из этих методов в отдельности, как правило, невозможно определить конформацню Б, тогда как нх комбинация в ряде случаев дает информацию, к-рая сравнима по ценности с рентгеноструктурным анализом 480 БКЛКИ ЮЗ Рис 5 Расположение молекулы бактериоролопсииа в пурпурной мсмбравс У ~астап полипсвтилиай вели, лоступиме лли иолироваиии мктопсроксила. зой-Л протеолиза папаииом-р, киматриллсииом-бб и «арбоксипсптилазой А — СРА А -аититеиизм летермииаиты. Оптич.
методы позволяют следить за изменениями конформации Б. в процессе функционирования или при изменении окружающих условий. Комбинация этих методов лает информацию об относит. содержании в Б; элементов вторичной структурьп о расположении остатков триптофана относительно пав.сти белковой глабулы и о конфигурации связей С вЂ” б — 3 — С в дисульфидных мостиках. Прямую информацию о пространств. строении Б. в рре дает метод ЯМР.
Совр. методики ЯМР спектроскопии позволяют проводить практически полное отнесение сигналов в спектрах пептидов и небольших Б. (с мол и до 10.000) к определенным ядрам в молекуле. Использование гомо- ядерных ('Н вЂ” 'Н) и гетероядерных ('Н вЂ” 'лС) констант спин-спинового взанмод. дает возможность определять торсионные углы ф, ф н ы оси.
полипептидной цепи и торсионный угол у' боковых цепей амннокислотных остаткон С помощью ядерного эффекта Оверхаузера, сдвиговых и уширяющих реагентов (ионы парамагн. металлов, спиновые метки) измеряют расстояния межлу отдельными ядрамн молекулы. Т. обр.
для пептидов и небольших Б. удается определить пространств. структуру с разрешением до 0,3-0,4 нм. Несомненное достоинство ЯМР-спектроскопии-возможность получать ииформапию о динамике пространста структуры молекулы Б. Модификация Б. реагентами, несущими сноб. радикал (спинобая метка) или флуоресцентную группировку, позволяет судить о хим. окружении модифицируемой группы, а при наличии в Б. двух таких меток †измери расстояние между ними.
Теоретически возможно предсказывать в общем виде пространств. строение Би исходя из его аминокислотной последовательности. Такого рода расчеты проводят с помощью ЭВМ на основании закономерностей, выведенных в результате статистич. обработки данных для Б. с установленной пространстн структурой. В ряде случаев расчетные методы дают удовлетворительные результаты, к-рые помогают интерпретировать данные, полученные др. методами. При исследовании пространстн структуры Б. часто используют ограниченный протеолиз, проводящийся в мяг- 431 ких недеиатурирующих условиях, в к-рых гидролизуются исключительно пептидные связи, находящиеся на пов-сти глобулы Б.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
