Н.С. Зефиров - Химическая энциклопедия, том 1 (1110090), страница 149
Текст из файла (страница 149)
Этот процесс обратим: при устранении факторов, вызывающих диссоциацию, может происходить самопроизвольная реконструкция исходной четвертичной структуры. Явление носит общий характер: по принципу самосборки функционируют многие биол структуры. Способность к самосборке свойственна и отдельным фрагментам Б.-доменам. Более глубокие изменения конформации Б с нарушением третичной структуры наъ денатурацией. Свойства.
Физ.-хим. св-ва Б. определяются их высокомол. природой, компактностью укладки полипептидных целей и взаимным расположением остатков аминокислот. Мол. масса варьирует от 5 тыс до ! млц, а константы седиментации — от 1 до 20 (и выше) Средний уд, объем белковых молекул-0,70-0,75 ем~/г, а константы диффузии — 10~-10' смз/с. Максимум поглощения Б, в УФ-области спектра, обусловленный наличием ароматич. аминокислот, находится вблизи 280 им. Возбуждение электронов атома азота пептидной группы вызывает резкое увеличение поглощения при !85-240 нм. В ИК-облвсти спектра Б.
поглощают за счет СО- и ХН-групп при ! 600 и 3100-3300 см В р-рах Б. амфотерны. Изоэлектрнч. точки Б, могут иметь значения от < 1,0 (у пепсина) до !О,б (у цитохрома с) и выше. Боковые группы амииокислотных остатков способны вступать во многие р.ции. Б. дают ряд цветных р.ций, обусловленных наличием определенных аминокислотных остатков или хим.
группировок. К важнейшим из них относятся: бяуре»ювая реакчил (пептидные связях ксаняюл)яяяеынояал реакция (ароматич. ядра остатков тирозина, триптофана, феиялаланина), Адамкееича реакция (нилольное кольцо триптофана), Миллона реакция (фенольный радикал тирозина), Паули реа«яия (имидазольное кольцо гистидина), Сакагучя реакция (гуанидиновая группа аргннина) и иингидрлиоеал реакция (аминогруппа) Выделение. Один из первых этапов выделения Б.— получение соответствующих органелл (рибосом, митохондрий, ядер:, цитоплазматич.
мембраны) с помощью дифференциального центрнфугироваиия. Далее Б переводят в растворимое состояние путем экстракцин буферными р-рами солей и детергентов, иногда-неполярными р.рителями. Затем применшот фракционное осаждение неорг. солями '(обычгго (ХН»)зЗО»3', этаиолом, ацетоном или путем изменения рН, ионной сйлы, т-ры. Для предотвращения денатурации работу проводят при пониж. т-ре (ок. 4'С); с целью исключения протеолиза используют ингибиторы протеаз, нек-рые Б. стабилизируют полиоламн, напр.
глицерином. Дальнейшую очистку проводят по схемам, специально разработанным лля отдельных Б. или группы гомологичных Б Наиб. распространенные методы разделения-гель-проникающая хроматография, ионообменная и адсорбц. хроматография) эффективные методы-жидкостная хроматография высокого разрешения и ая»дивная хромашог)авзлл. Критерий чистоты Б.-гомогенность при электрофорезе, хроматографии и ультрацентрифугировании. Одноцепочечиый Б. должен быть гомогенным при Х- и С-концевом анализе (см. ниже) Примесь сопутствующих ферментов определяют с помощью специфич. субстратов; высокую чувствительность имеют иммунохим. методы (обычно до 10 ' мзггмл примесного антигена) Мезеды исследованвя первнчиой структуры.
Знание первичной структуры Б.-основа для опрелеления его вторичной и третичной структур, выяснения расположения фуикц. групп в активном центре Б, и построения модели его функ- 475 ционирования. Исследование первичной структуры мутантных Б. позволяет на молекулярном уровне характеризовать различия между штаммами микроорганизмов, фагов и вирусов, выяснять молекулярные причины генетич. болезней. Данные по первичной структуре используют при установлении и проверке таксономнч. взаимоотношений между разл. видами живых организмов, построении филогеиетич. древа и анализе хода биол, эволюции. Для определения аминокислотной последовательности Б. прежде всего разделяют его полипептидные цепи (если макромолекула состоит из носк.
цепей). Затем определяют амннокислотный состав цепей, Х- и С-концевые аминокислотиые остатки и амннокислотные последовательности. Полипептидные цепи подвергают специфич. расщеплению протеолитич. ферментами или хим. реагеитами. Смесь образовавшихся фрагментов разделяют и для каждого из них определяют аминокислотный состав и аминокнслотную последовательность. При необходимости крупные фрагменты дополнительно расщепляют к.-л.
способом на более мелкие. Порядок расположения фрагментов выясняют путем расщепления молекулы Б по др связям и анализа образующихся при этом «перекрывающихся» фрагментоц Анализ аминокислотного состава включает полный гидролиз исследуемого В илн пептида и количесть определение всех аминокислот в гидролизате.
Для гидролиза обычно используют 5,7 н. водный р-р НС), а при анализе содержания триптофана-4 н. метансульфоновую к-ту, содержащую 0,2% 3(2-аминоэтил)иидола, или кипачение со щелочью. Количеств. определение аминокислот в гндролизате проводят с помощью аминокислотного анализатора. В большинстве таких приборов смесь аминокислот разделяют на ионообменных колонках, детекцию осуществляют спектрофотометрически по р.ции с нингидрином или флуоримстрически с испольюванием флуорескамина или о-фталевого диальдегида.
В последнем случае можно анализировать до 0,1-005 нмоль аминокислоты, Наиб. распространение для определения Х-концевых остатков находит дансильный метод. Его первая сталия— присоединение дансилхлорида (1-диметнламннонафталнн-5- сульфохлорида) к непротоннрованной а-аминогруппе с образованием дансилпептида (ДНС-пептида) Затем послелний гидролизуют 5,7 н. р-ром НС! при 105'С, в результате чего освобождается Н-концевая и-ДНС-аминокислота„ к-рая обладает интенсивной флуоресценцией в УФ-областя спектра; для ее идентификации достаточно 0,1-0,5 нмола в-ва. Для определения С-концевых остатков чаше всего используют ферментативиый гидролиз карбокснпептидазамн, к-рые специфически расщепляют пептидные связи, образованные С-концевыми остатками.
Поскольку после отщепления концевых остатков фермент атакует поспел, пептидные связи, измерение скорости отшепления отдельных аминокислот позволяет анализировать также и С-концевую амииокислотиую последовательность, Важнейший этап в определении первичной структуры Б.-расщепление макромолекулы на пептидные фрагменты.
Среди ферментативных методов расщепления наиб, широко используется гидролиз трипсином. Трипсии обладает уникальной субстратной специфичностью: гилролизует исключительно связи, образованные карбоксильными группами осн. аминокислот-лизина н аргинина. Введение заместителей в боковые цепи лизина или аргинина препятствует гидролизу по остаткам модифицирож аминокислот н позволяет гидролизовать макромолекулы избирательно только по остаткам аргинина или лизина. Особенно часто используется модификация остатков лизина с послед. гидролизом Б, по остаткам аргииина. Модифицирующие агенты-ангидриды дикарбоновых к-т (янтарной, малеиновой и цитраконовой).
Из др. протеолитич. ферментов широко применяется протеаза из ЗырЬу!ососспз апгепз (гидролизует связи, образованные карбоксильными труппами остатков глутаминовой к-ты, а в нек-рых случаях и остатков 476 БЕЛКИ 251 0 0 1 и' -ХН-СН-С-Х Н вЂ” Снг-С- — ~- СН с )ЧН2 «О — ~ -ХН-СН вЂ” С ао ХНОН СН вЂ” С вЂ” ОН 0 а-аспартнагнарпнсапат 0 1 + ХН,— СН,— С— -ХН вЂ” Сн — С ОН СН вЂ” С ХНОН г 0 )т - аспартннгнпрпнсанат В ряде случаев для расщепления Б. используется метод частичного кислотного гидролиза. Наиб.
чувствительны к действию к-т аспартильные пептидные связи и особенно связь аспартил-пропил. При выборе методов разделения пептидов учитывают физ.-хим. свойства, кол-во и длину молекул разделяемых соединений. Для первичного фракционироваиия смесей коротких пептидов, содержащих до )5 — 20 аминокислотиых остатков, в большинстве случаев используют ионообменную хроматографию на катионитах. Дальнейшее разделение и очистку проводят с помощью хроматографии и электрофореза на бумаге или пластинках с тонким слоем целлюлозы или силикагеля.
Осн.сложность при фракцнонировании молекул крупных пептидов (более 20 амииокнслотных остатков)-их св-во слипаться в водных р.рах друг с лругом с образованием высокомол. агрегатов, не подаающихся разделению. Для предотвращения агрегации в буферные р-ры вводят моче- вину (до 8 М), гуанидинийхлорид (до 6 М) илн детергенты (додецилсульфат Ха); разделение часто проводят с помощью гель-проникающей хроматографии и ионообменной хроматографии. Эффективный метод разделения — жидкостная хроматография высокого разрешения иа носителях с обращенной фазой. Для селективного выделения пептидов, несущих химически активные группировки, м,б.
использована хемоспецифич. (ковалентная) хроматография, основанная на образовании ковалентиой связи пелтнда с носителем. Напр., для выделения цистеинсодержащих пептидов используют алию тиол-дисульфидного обмена, с помощью к-рой пептиды через дисульфидный мостик присоединяются к модифицированному 2,2ьдипиридилднсульфидом носителю. Ковалентно связанные с носителем цистеинсодержащие пептиды м.б. легко элюированы при послед.
обработке (3-меркаптоэтанолом. Осн. метод исследования аминокислотной последовательности пептилов н Б. †х. деградация с помощью фенилизотиоцианата. Этот метод поз! валяет последовательно от- ХН щеплять Х-концевые аминокнслотные остатки в виде фенилтиогидантоинов, о С~ +„ ! к-рые абсорбируют свет в О + ' Н СО УФ-области с максимумом ОН поглощения 265-270 нм. Н Для их идентификации наиб, часто используют тонкослойную хроматографию, жидкостную хроматографию высокого давления, а также масс-спектрометрию. Широкое применение нашел также метод, сочетающий послеловательную деградацию пептнда по Эдману (см. Эдмона деградация) с анализом Х-концевых аминокислотных остатков в ви- применяемыйметионина (вы- СН 82 С Х ! ! СН, (Вг / исоон СН й ,,О ! СН вЂ” С СН ~ХН ХН С 0 СН 'т.т .С~Х вЂ” 8 в, Р СН, / СН, а й СН вЂ” С СН тт./ '/ ХН ХН С 1 0 / СН СН, О й ! ! СН вЂ” С СН / з/ "ХН 'ХН С 0 СН / иаО СН 0 ! СН вЂ” С / ~ХН О й СН ! ХН2 С 0 Для расщепления Б по карбонильной группе остатка триптофана используют Х-бромсукцинимид или более селективный 2-(2-нитрофенилсульфенил)-3-метил-3-броминдол (ВХРБ-скатал) (выход )0-50;,'); ! ХН ! СН -СН 3 2 С вЂ ХН вЂ СН в .3вг г О Н ХН т СН,-СН Гт 0 С ХН вЂ” СН вЂ” Сов Х Вг Н Н,О -наг Гилроксиламин расщепляет пептидные связи между остатками аспарагнна и глицина.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
