Г. Кристиан - Аналитическая химия, том 2 (1108738), страница 91
Текст из файла (страница 91)
Приготовьте рабочие стандартные растворы с содержанием 100, 200, 300 и 400 мг глюкозы в 100 мл, разбавляя исходный раствор 0,25%-м раствором бензойной кислоты (например, можно разбавить 5,0, 10,0, 15,0 и 20,0 мл до 50 мл). Подготовка к работе Высушите глюкозу при 100 'С в течение 1 ч и охладите в эксикаторе. Методика Перенесите пипеткой 0,5 мл образца крови, сыворотки или плазмы крови* в коническую колбу объемом 50 мл и добавьте 4,5 мл 0,06 М раствора гидроксида бария.
Перемешайте раствор и медленно добавьте 5,00 мл 2,2%-го раствора сульфата цинка. Тщательно перемешайте и оставьте смесь на 5 мин. Профильтруйте раствор в сухую колбу или отцентрифугируйте осадок в сухой пробирке. Таким же образом приготовьте фильтраты для раствора контрольного опыта и стандартных растворов, используя аликвоты воды и соответствующих стандартных растворов объемом 0,5 мл. Перенесите пипеткой аликвоту 0,2 мл каждого фильтрата в чистую сухую пробирку и с интервалами в 30 с добавьте к ним по 1,00 мл раствора ферментного реактива.
Сразу же после добавления реактива поместите пробирку в водяную баню с температурой 37 'С (можно проводить реакцию и при комнатной температуре в течение 45 мин, но чувствительность при этом будет несколько ниже). Для анализируемой пробы возьмите две аликвоты. Ровно через 30 мин выньте каждую пробирку в том же порядке (также с интервалами 30 с) и добавьте 50 мл 3 М Нзб04." Серная кислота эффективно тормозит протекание ферментативной реакции. Не ранее, чем через 5 мин, но не пологое, чем через 1 ч, измерьте оптические плотности растворов при 540 нм относительно раствора контрольного опыта. При помощи электронных таблиц постройте градуировочный график и найдите концентрацию глюкозы (мг!дл) в пробе.
Можно использовать имеющиеся в продаже стандартные препараты сыворотки крови (например, 5гегзаьоб. Существуют и препараты с «аномальным» содержанием глюкозы — от 90 мг!лл (норма) до 300 мг!дл и выше. Альтернативой могут быть водные растворы глюкозы. В этом случае стадию осаждения белков опускают, а вместо растворов гидроксида бария и сульфата цинка добавляют 9,5 мл воды. При низких концентрациях глюкозы реакция имеет псевдопервый порядок, но при высоких концентрациях реакция замедляется. Поэтому в области высоких концентраций зависимость оптической плотности от времени инкубирования может быть нелинейной.
ПрОТСЧН0-ИНжБКцИОННЫй анМИЗ, раб а Зб Проточно-инжекционный анализ Работа 36. Определение физических параметров аналитической проточно-инжекционной системы Проба (0,002%-й БТС) Слив Носитель Основы Цель данной работы — приобрести навыки в работе на проточно-инжекционной установке и оценить: (а) скорости потоков носителя и реагента; (б) объемы петли инжектора и проточных каналов; (в) коэффициент дисперсии 2) зоны пробы в максимуме пика (для одноканальной и двухканальной схем); (г) максимальную частоту ввода проб. Все эксперименты выполняются по двухканальной схеме, кроме эксперимента по определению коэффициента дисперсии для одноканальной схемы.
Уравнения тт=Со~С=НотН Р = Со)С = Но)Н Но — сигнал детектора, соответствующий стационарному состоянию (чистый раствор пробы), а Н '" — сигнал в максимуме пика инжектированной пробы. реактивы и растворы 1. Имеются в лаборатории. Исходный 0,1 М раствор буры ()ЧазВлОТ), исходный 0,4%-й (масса: объем) раствор бромтимолового синего (БТС; 0,4 г вещества растворяют в 25 мл 96%-го этанола и разбавляют до 100 мл 0,01 М раствором буры).
ВНИМАНИЕ! Бромтимоловый синий нельзя инжектировать в кислые растворы, поскольку этот индикатор в кислотной форме адеорбируется на стенках пластмассовых трубок. 2. Готовят перед работой. Разбавьте 100 мл 0,1 М раствора буры до 1 л для приготовления 0,01 М раствора. Разбавьте 1 мл 0,4%-го раствора бромтимолового синего до 200 мл 0,01 М этим раствором буры. Полученный 0,002%-й раствор БТС будет служить в качестве рабочего. Оптическая плотность этого раствора в кювете толщиной 1 см составляет около 1,2.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ Сборка установки Соедините между собой трубки перистальтического насоса, инжектор, реактор и детектор в соответствии с описанием прибора или указаниями преподавателя. Установка включает три трубки перистальтического насоса — для потоков носителя, реагента и пробы, все с внутренним диаметром 0,89 мм (маркировка— две оранжевые полоски). Присоедините трубку для отбора пробы ко входу петли инжектора, а трубку для транспортировки пробы — к выходу петли. Раствор пробы подается в петлю при помощи перистальтического насоса. Методика 1. Общая проверка системы.
Включите детектор и записывающее устройство и дайте нм прогреться. Заполните сосуды для носителя и реагента 0,01 М раствором тетрабората натрия, а маленький стаканчик примерно наполовину наполните 0,002%-м раствором бромтимолового синего.
Опусптге в сосуды соответствующие трубки. Установите инжектор в положение «Загрузка» и включите перистальтический насос. Каналы начнут заполняться, а раствор — поступать в емкость для слива. Синий раствор пробы начнет заполнять петлю инжектора.
Прокачивайте растворы до полного удаления пузырей воздуха. (ПРИМЕЧАНИЕ. Иногда пузырь воздуха может застрять в детекторе, что приведет к его «зашкаливанию». Самый простой способ вытеснить его оттуда — ввести в поток носителя большую порцию воздуха, резко вынув соответствующую трубку из раствора, а затем погрузив ее обратно.) Настройте детектор на длину волны 620 нм. Инжекгированная проба должна давать пик с оптической плотностью в максимуме около 0,15 (при длине оптического пути кюветы 1 см). Настройте записывающее устройство (компьютер или самописец) на соответствующий диапазон значений. При использовании самописца установите скорость движения ленты 0,5 см/с.
При непрерывном прокачивании носителя переведите инжектор в положение «Ввод» и пронаблюдайте, как синяя зона пробы движется по каналам. Если инжектор устроен так, что проба и в положении «Ввод» продолжает засасываться (и„таким образом, расходуется зря), выньте трубочку для ввода пробы из раствора (инжектор будет прокачивать воздух). При достижении зоной пробы детектора должен наблюдаться пик с последующим возвращением сигнала до уровня базовой линии. При необходимости отрегулируйте чувствительность записывающего устройства так, чтобы высота пика составляла около 2/3 всей шкалы.
После того, как зона пробы выйдет из детектора, переключите инжектор в положение «Загрузка», чтобы вновь заполнить петлю. Заполнение продолжайте до тех пор, пока раствор пробы не достигнет конца трубки для слива инжектора. Это гарантирует хорошее промывание петли инжектора новой порцией пробы. После этого введите пробу и снова зафиксируйте пик. Повторите эти действия несколько раз до тех пор, пока не убедитесь, что система работает нормально, дрейф показаний детектора отсутствует, а пики хорошо воспроизводятся. После этого можно приступить непосредственно к выполнению эксперимента. ПРОТОЧНО-ИНЖЕКЦИОННЫЙ АНАЛИЗ.
Работа 36 2. з. 4. 5. 6. Определение скоростей потоков. Заполните мерный цилиндр объемом 10 мл дистиллированной водой, запишите начальное значение объема и погрузите в цилиндр трубку для потока носителя. Одновременно включите насос и секундомер (или заметьте время по часам). Прокачивайте раствор в течение 5 мин, выньте трубку и выключите насос. Запишите объем воды, оставшейся в цилиндре. Рассчитайте скорость потока в млlмин. Точно так же определите скорости потока реагента, а затем пробы (инжектор в положении «Загрузка»).
Наконец, измерьте скорость потока на выходе из детектора, собирая слив в течение 5 мин. Если для всех каналов используются трубки одинакового внутреннего диаметра, то скорости всех потоков должны быть близки. Скорость потока на выходе из детектора должна быть равна сумме скоростей потоков носителя и реагента. Заметьте, что объемная скорость потока прямо пропорциональна квадрату внутреннего радиуса трубки Я (т.
е. площади сечения кВ'). Поэтому скорости потоков можно изменять, выбирая трубки подходящего диаметра. Оценка обьема петлиинжектора. При включенном насосе переведите инжектор в положение «Загрузка» и выньте трубку для ввода пробы из раствора. При этом инжектор заполнится воздухом. Затем погрузите трубку в раствор пробы и секундомером измерьте время от начала поступления пробы в петлю инжектора до ее выхода из петли. Повторите измерения несколько раз и рассчитайте среднее значение. Зная скорость потока (измеренную ранее) и время заполнения петли, рассчитайте объем петли в мкл. (ПРИМЕЧАНИЕ. Эта величина является оценочной. Она не включает в себя «мертвый» объем отверстий в роторе инжектора, примыкающих к петле.) Оценка обьема проточной системы. Заполните петлю инжектора воздухом и введите его в поток носителя.
Измерьте время движения пузыря до точки соединения потоков носителя и реагента. Из этой величины и скорости потока носителя, найденной ранее, рассчитайте объем системы (мкл) между инжектором и точкой соединения потоков. Подобным образом измерьте время движения воздуха от точки соединения потоков до детектора. Из этой величины и суммы скоростей потоков носителя и реагента, определенных ранее, рассчитайте объем системы (мкл) от блока реактора до детектора. Определение общего «мертвого» времени. При включенном записывающем устройстве одновременно введите пробу и включите секундомер. Измерьте время, необходимое для достижения пробой детектора, т. е. до начала отклонения самописца.
Эта величина представляет собой «мертвое» время от момента инжекции до начала регистрации. Время для промывания блока ввода пробы. При введении множества проб важно, чтобы трубка для ввода пробы и петля инжектора были полностью ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ отмыты от предыдущей пробы. Заполните трубку для ввода пробы и петлю инжектора воздухом, а затем, при включенном насосе, погрузите трубку в раствор пробы и измерьте время, необходимое для заполнения всей петли.
В ходе всех последующих экспериментов прокачивайте пробу через петлю дозатора в течение времени, как минимум втрое превышающего измеренное. Это необходимо для того, чтобы петля была как следует промыта новым раствором. По величине скорости потока пробы рассчитайте также объем раствора, требуемый для промывания. 7. Определение коэффициента дисперсии: двухканальная система. Отрегулируйте чувствительность записывающего устройства так, чтобы в пике инжектированной пробы сигнал состашил около 1/5 всей шкалы. Введите пробу несколько раз и рассчитайте среднюю высоту пика (Н '"). Выключите насос и погрузите трубки для носителя и реагента в раствор пробы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
