Г. Кристиан - Аналитическая химия, том 2 (1108738), страница 89
Текст из файла (страница 89)
В работе рекомендуется использовать растворы в 0,5 М спиртовом растворе НС!. Однако для ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ. Работа 31 435 растворения некоторых аминокислот может потребоваться добавление к этому раствору значительных количеств воды. В этом случае особенно важно, чтобы пятно раствора пробы, наносимое на пластинку, было как можно меньше. Кроме того, между нанесением пятна и хроматографированием необходимо выждать достаточно времени, чтобы растворитель полностью испарился. Чтобы улучшить разрешение хроматографических зон, можно использовать технику двумерной хроматографии.
Для этого пятно пробы наносят вблизи левого нижнего угла пластинки (при размерах пластинки 20х20 см — на расстоянии 2 см от нижнего и левого краев). Сначала пробу хроматографируют как обычно, затем пластинку вынимают и высушивают, а после этого поворачивают на 90' против часовой стрелки и для разделения плохо разделившихся компонентов еще раз хроматографируют, применяя другую подвижную фазу. Экспериментальные значения Я~аминокислот зависят от множества факторов, включая концентрации как самих аминокислот, так и других компонентов, присутствующих в пробе.
По этой причине используемые для сравнения растворы, содержащие индивидуальные аминокислоты, должны быть по всем параметрам максимально подобны раствору пробы. При проявлении хроматографических зон нингидрином предел обнаружения составляет 0,01 — 0,5 мкг в зависимости от природы аминокислоты, а также от конкретного способа разделения. Окраску, образующуюся при действии нингидрина, можно стабилизировать.
Для этого проявленную пластинку следует дополнительно опрыскать раствором, полученным смешением 1 мл насыщенного водного раствора нитрата меди, 0,2 мл 10','е-й азотной кислоты и 100 мл 95тс-го этаиола. После этого пластинку выдерживают над парами аммиака до появления красной окраски медных комплексов. Окраска устойчива только в отсутствие кислот. Приблизительное значение А, подвижная фаза №! подвижная фаза № 2 Аминокислота Алании Аргннин(моногилрохлорил) Аспарагин Валин Глнцин Глутаминовая кислота Лейцин Лизин Метионин Серии Тиров ин Триптофан Цистин 0,29 0,15 0,20 0,40 0,22 0,33 0,57 0,10 0,47 0,25 0,52 0,55 0,12 0,50 0,15 0,43 0,60 0,39 0,40 0,69 0,20 0,63 0,45 0,69 0,71 0,22 436 ПРАКТИЧЕСКИЕ РАБОТЫ Работа 32. Газохроматографический анализ тройной смеси углеводородов Основы Смесь пентана, гексана и гептана разделяют методом газовой хроматографии.
При этом можно использовать разнообразные колонки различных типов. Для детектирования подойдет простейший детектор по теплопроводности (катарометр, «горячая спираль»). Для каждого вещества проводят градуировку по стандартной смеси определяемых компонентов. Установление последовательности хроматографических пиков осуществляют хроматографированием индивидуальных веществ. Другой вариант работы предусматривает анализ двухкомпонентной смеси и-гексана и и-гептана.
В этом случае и-пентан применяют как внутренний стандарт. Реактивы и растворы 1. Имеются в лаборатории. Ацетон. 2. Готовят перед работой. Стандартная смесь определяемых компонентов— и-пентана (5,00 мл), и-гексана (10,00 мл) и и-гептана (15,00 мл). Все смеси следует готовить непосредственно перед работой и хранить в закрытых сосудах с пластмассовыми пробками. Можно приготовить смесь с заданным соотношением масс (взвешивая отдельные компоненты или рассчитывая их массы по величинам объемов и плотностей). В этом случае результаты анализа следует представить в виде массовых долей.
Внимание. При работе с микрошприцами будьте очень осторожны. Не повредите их. Правильные результаты можно получить лишь при правильном уходе за шприцами. Каждый раз после использования шприца выньте поршень, тщательно промойте шприц ацетоном и оставьте до полного высыхания. Промывание можно сделать при помощи другого шприца, заполнив его ацетоном, вставив в отверстие стеклянной трубки использованного шприца и пропуская ацетон до полной очистки внутренней поверхности шприца. Для высушивания пропустите через трубку шприца ток воздуха. После полного высыхания внутренняя поверхность шприца будет казаться шероховатой. Методика Получите у преподавателя смесь для анализа.
Строго следуйте всем инструкциям по работе на приборе и указаниям преподавателя. Не производите никаких изменений температурного режима. Пользуясь подходящим шприцам, получите хроматограммы каждого отдельного компонента смеси, три хроматограммы стандартной смеси и три хроматограммы анализируемой смеси. По окончании работы выключите прибор в соответствии с указаниями преподавателя. Особенно важно при этом соблюдать правильный режим уменьшения потока газа-носителя и порядок перевода детектора в «ждущий» режим.
Вымойте, ополосните ацетоном и высушите все шприцы и посуду. ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ. Работа 33 437 Обработка данных Для вычисления площади хроматографического пика достаточно умножить его высоту на ширину на половине высоты *. Необходимые для этого измерения выполните с помощью миллиметровой линейки. Если прибор позволяет автоматически определять площади пиков и выводить их на печать, используйте эти значения. Компоненты смеси идентифицируют по их положениям на хроматограмме (временам удерживания). Стандартную смесь используют для количественной градуировки.
Отклик детектора к разным веществам неодинаков, поэтому для каждого компонента необходимо определить коэффициент относительной чувствительности. Проще всего это можно сделать путем непосредственного сравнения абсолютных площадей пиков с относительными долями соответствующих компонентов в стандартной смеси. Так, если пик компонента А с содержанием 25',3 имеет площадь, равную 40, то площадь того же компонента, равная 80, соответствует 50ог3 содержанию.
Конечно, более точным было бы построение для каждого компонента градуировочной зависимости площади пика от содержания. В этом случае оказывается учтенным возможное изменение общего объема при смешении веществ. По средним значениям площадей пиков рассчитайте для каждого компонента среднее значение его содержания (огб об.) в анализируемой смеси. Градуировка методом внутреннего стандарта Преподаватель может выдать вам для анализа двухкомпонентную смесь н-гексана и и-гептана и предложить добавить во все растворы и-пентан в качестве внутреннего стандарта.
В этом случае стандартную смесь приготовьте, как описано выше, а к 25,00 мл пробы добавьте 5,00 мл и-пентана. Для градуировки используйте отношения площадей пиков определяемых компонентов к площади пика и-пентана. Подробнее о методе внутреннего стандарта см. в гл. 20. Работа 33. Качественный и количественный анализ фруктовых напитков на витамин С методом высокоэффективной жидкостной хРоматоГРафии""' Основы Несколько проб соков непосредственно хроматографируют на колонке с сильноосновным анионобменником, используя УФ-детектор при 254 нм.
Наличие Вместо расчетно~о способа определения площадей пиков можно использовать несколько более точный способ, основанный на взвешивании бумаги. Сделайте бумажную копию хроматограммы. Из исходной хроматограммы аккуратно вырежьте по контуру каждый пик. Взвесьте вырезанные пики на аналитических весах н возьмите в расчет значения масс в качестве меры площади. В этом случае приложите «вырезкив к отчету о работе. Можно определять плошади пиков и электронным интегрированием. Лучше использовать не абсолютные, а относительные значения площадей (по отношению к сумме площадей всех пиков).
При этом устраняется возможная погрешность, связанная с дозировкой пробы. — Прим. перев. Продукт окисления аскорбиновой кислоты — дегидроаскорбиновая кислота — не поглощает в УФ-области и не обнаруживается описанным методом. Для получения долее точных результатов пробу следует предварительно обработать восстановителем, например Н 8 [Кое ет а1., Х Взо!. Сьев., 174 (1984) 201], для восстановления дегндроаскорбиновой кислоты. ПРАКТИ4ЕСКИЕ РАБОТЫ 438 либо отсутствие витамина С устанавливают, сравнивая времена удерживания пиков для пробы и чистого раствора витамина С (1-аскорбиновой кислоты). Ко- личественно содержание витамина С (в тех пробах, где он присутствует) нахо- дят по величинам площадей пиков.
Реактивы и растворы 1. Имеются в лаборатории. Подвижная фаза (раствор 1,36 г/л КНзРОл, приготовленный на дистиллированной деионизированной воде), 1-аскорбиновая кислота. Методика 1. 2. Готовят перед работой. Стандартный раствор витамина С. Взвесьте 50 мг 1-аскорбиновой кислоты с точностью до 0,1 мг, перенесите в мерную колбу объемом 50 мл, растворите и разбавьте до метки дистиллированной деионизированной водой. Раствор следует готовить в день выполнения работы. Концентрация раствора составляет 0,1%. Из него разбавлением приготовьте 0,05% и 0,02% стандартные растворы. Градуировка.
Руководствуйтесь указаниями преподавателя о порядке работы на приборе, включая необходимую настройку. В состав прибора входит колонка с сильноосновной анионообменной смолой. Для типичного давления 1000 фунт/дюймз (около 70 атм) скорость потока составляет около 0,5 мл/мин. При помощи шприца объемом 10 или 25 мкл введите аликвоту 1О мкл 0,02%-го стандартного раствора витамина С и снимите хроматограмму. Сделайте то же самое с 0,05%-м и 0,1%-м стандартными растворами.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
