Г. Кристиан - Аналитическая химия, том 2 (1108738), страница 60
Текст из файла (страница 60)
Для получения высокоточных результатов белки определяют микрометодом Кьельдаля; погрешность биуретовой реакции, которая используется в клиническом анализе для определения общего содержания белка, составляет около 4'й. Кислая и щелочная фосфатазы — это ферменты, содержащиеся в крови и проявляющие активность соответственно в кислой и щелочной среде. В качестве субстрата для их определения применяют глицерофосфат. При соответствующем значении рН данные ферменты гидролизуют субстрат с высвобождением фосфата.
Можно использовать и другие субстраты с фосфатными группами. Барбитураты — это лекарственные вещества, которых в норме в крови быть не должно. В неионизированной форме их экстрагируют из крови метиленхлоридом. Затем, уже в ионизированной форме, их можно реэкстрагировать 0,45 М раствором ХаОН.
Ионизированная форма (в отличие от неионизированной) способна поглощать свет в ультрафиолетовой области. Спектр поглощения подтверждает наличие барбитуратов на качественном уровне. Ионизированная форма при рН 13 — 14 имеет максимум поглощения между 252 и 255 нм и минимум — между 234 и 237 нм; при рН 9,8 — 10,5 существует еще одна ионизированная форма с максимумом поглощения при 240 нм. Некоторые из перечисленных выше тестов осуществляют и при анализе образцов мочи, причем часто применяют те же самые методы.
Поскольку в моче определяемые компоненты присутствуют в других концентрациях, а также в связи с наличием мешающих веществ, методики проведения анализа некоторым образом модифицируют. Обычно для анализа используют мочу, собранную пациентом за 24 ч, поскольку общее количество выделяемых за сутки веществ гораздо важнее их концентрации в отдельной пробе. На рис.
24.1 проведено сравнение состава мочи и сыворотки крови. При необходимости получения быстрых результатов, имеет смысл выполнять так называемый анализ по месту лечении. Например, при сердечном приступе длительность периода от появления симптомов до начала лечения играет решающую роль в минимизации нарушений сердечной деятельности, и работа службы скорой помощи непосредственно зависит от результатов анализа крови, подтверждающих наличие сердечного приступа. В данном случае транспортировка образцов крови в лабораторию для получения результатов крайне ГЛАВА 24.
КЛИНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ 308 неэффективна. Служба скорой помощи должна быть снабжена прикроватными ферментативными анализаторами, тестирование с помощью которых требует минимальных манипуляций: поместить образец крови, нажать кнопку и получить результат не позднее, чем через минуту. Одним из наиболее хорошо зарекомендовавших себя биосенсорных анализаторов является персональный анализатор глюкозы в крови, которым пользуются больные диабетом.
Пациент просто прокалывает палец стерильным ланцетом и помещает маленькую капельку крови на тестовую полоску; глюкозооксидаза на полоске катализирует окисление глюкозы, сопровождающееся выделением пероксида водорода, концентрацию которого можно измерить электрохимическим или фотометрическим методом. Дополнительную информацию вы можете получить на сайтах ЬПР даЪЬон.сош!б1аЬе1ез.
Ьвп! и вчяжхйаЪез!сзпрр!у сош. 24.4. Иммуноанализ Иммунологические методы, отличающиеся очень высокой селективностью, используются для определения гормонов, лекарств, витаминов и других веществ, присутствующих в количестве нескольких нанограммов и меньше. Данные методы основаны на взаимодействии антигенов и специфических антител, приводящем к образованию комплекса или осадка. Первым аналитическим применением иммуноанализа был радиоиммуноанализ (РИА), с помощью которого Берсон и Ялоу продемонстрировали возможность селективного определения низких концентраций инсулина [1О]. Рутинным методом РИА стал лишь в конце 19б0-х и начале 1970-х годов — в период, когда лабораторные методы с рекордной скоростью стали входить в клиническую практику, что было обусловлено острой необходимостью.
В современных клинических лабораториях иммуноаналнз и родственные методы, базирующиеся на конкурентном связывании, используются очень широко. Огромная роль данной технологии была подтверждена тем, что в 1977 г, уже после смерти Берсона Розалии Ялоу получила Нобелевскую премию по физиологии за вклад в развитие метода ( а!шах сопипоЬеЬпоЬе1 Ьпп!). В методе иммуноанализа обычно используют конкуренцию между определяемым антигеном и меченым стандартным антигеном за специфические участки распознавания на антителе. Меткой может служить радиоактивный изотоп, фермент или флуоресцентный краситель.
Далее мы рассмотрим общие принципы иммуноанализа, а от них перейдем к обсуждению деталей иммуноанализа с флуоресцентной и ферментативной метками. Принципы иммуноанализа В иммуноанализе соединились чувствительность радиохимических, флуоресцентных или ферментативных методов анализа и специфичность иммунологии. Иммунология изучает антигены и их реакции с антителами, т. е.
защитные механизмы организма, опосредованные антителами и направленные против чужеродных агентов (рис. 24.2). Аитиген (например, гормон) представляет собой глава г4 клиническая кимия лннескоч виде. за по его назвали Ес-фра~мензоы ($гаушеп1, стук!аизкаЫеи Ес-фраз мент нчест практинески инвариантнукз структуру, в то время как ЕаЪ-фр!п менты содержат у нютки псременноьо состава, придающие антителам ик специфн шосзь. Участки, ш раюшне основнук> роль в связывании, расположены а концевой области 1 аЬ-фраг ментов Рзакрашенные области на рис. 24.4И 24.4. ИММУНОАНАПИЗ Для таких комплексов К принимает достаточно высокие значения: обычно от 104 — 10'б.
Связывание достигается за счет действия слабых сил (вандерваальсовых, электростатических и гидрофобных), но в нем принимает участие большое количество групп. При добавлении соли, а также при повышении рН, температуры или полярности растворителя связи разрываются, что приводит к диссоциации комплекса. Все методы иммуноанализа основаны на исходном открытии Берсона и Ялоу, которыми было показано, что антитела к антигенному гормону инсулину в низкой концентрации можно детектировать радиохимическим способом по их способности связывать меченый инсулин (содержащий ) з) 1). Например, в радиоиммуноанализе (РИА) определение неизвестной концентрации антигена базируется на том, что меченый и немеченый антиген (из образца или стандартного раствора) конкурируют за участки связывания на молекулах антител (рис.
24.5). Сначала в реакционный сосуд помещают раствор антител (антисыворотку), меченый антиген и образец сыворотки, в котором может находиться немеченый (искол(ый) антиген. В результате инкубации образуются комплексы антигенантитело (Аг — Ат). Если немеченый антиген отсутствует, происходит связывание определенной доли меченого антигена (Аге). По мере увеличения концентрации немеченого антигена (Аг) он постепенно вытесняет меченый антиген из участков связывания на молекулах антител, поскольку число таких участков ограничено.
После разделения связанных и несвязанных (свободных) антигенов с помощью прямых и косвенных методов измерения измеряют концентрацию меченого антигена (по наличию радиоактивной или флуоресцентной метки) в одной или обеих фракциях. Для проведения анализа исходный раствор антител разбавляют таким образом, чтобы в отсутствие немеченого стандартного или неизвестного антигена было связано около 50% меченого Аге. Снижение количества связанного анти- гена при добавлении образца указывает на наличие в нем немеченого антигена. Используя набор растворов стандартного антигена с известными концентрациями, строят градуировочную кривую в виде зависимости доли связанного меченого антигена (либо отношения связанного и свободного антигена) от Ат (антитело] Аг*-Ат и Аг-Ат (связанные) Разделение Аг -Ат и Аг-Ат + (связанные) Аг* и Аг (свободные) Аг* Инкубация (антиген с радиоактивной меткой) Аг (антиген из анализируемого или стандартного образца) Аг* и Аг (свободные) РИ0.
24.5. Принцип радиоиммуноанализа ГЛАВА 24. КЛИНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ РИС. 24.6 30 с и 40 с о 30 о с го о с с 10 рт Типичная градуировочная кривая в иммуноанализе 0 — 3 -2 — ! 0 ! 2 3 4 3 Логарифм концентрации (нгумл) концентрации немеченого антигена, и определяют неизвестную концентрацию антигена. Пример типичной градуировочной кривой представлен на рис.
24.6. Обратите внимание на широкий диапазон определяемых концентраций (от 10-2 до 101 нг/мл на относительно прямолинейном участке), а также на высокую чувствительность метода. Наклон градуировочной кривой и, следовательно, диапазон измерений и чувствительность зависят от исходного разбавления раствора антител. С одной стороны, с разбавлением антител возрастает чувствительность, но с другой стороны, при использовании более концентрированного раствора увеличивается охватываемый диапазон концентраций антигена. Кроме того, как уже говорилось ранее, для достижения высокой чувствительности рекомендуют разбавлять антисыворотку таким образом, чтобы связывалось примерно 50% меченого антигена (при его очень низкой суммарной концентрации) в отсутствие немеченого антигена.
Смысл этого заключается в том, что снижение на 50% исходного отношения связанного и свободного антнгена, равного 1,0 (т. е. при начальном связывании 50% антигена), можно определить более точно, чем такое же (в %) снижение исходного значения, равного, скажем, 10 (исходно связан 91% антигена). В первом случае доля связанного антигена снизится с 50% (связанный/свободный = 1,0) до 33% (связанный/свободный = 0,5), а во втором— с 91% (связанный!свободный = 10) до 83% (связанный/свободный = 5). Чувствительность определений в начальной части кривой можно повысить, используя минимально возможное количество меченого антигена.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
