Г. Кристиан - Аналитическая химия, том 2 (1108738), страница 64
Текст из файла (страница 64)
Обычно ЯХР встречаются у всех людей в одних и тех же позициях в геноме. Уже идентифицировано около трех миллионов таких участков, а во всей человеческой популяции их, по-видимому, существует около 10 млн. Многие нуклеотидные замены несущественны, однако наличие ЯНР в некоторых определенных ГЛАВА 25. ВЕК ГЕНО — ГЕНОМИКА И ЛРОТЕОМИКА: СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК И АНАЛИЗ БЕЛКОВ участках строго коррелирует с наличием специфического заболевания. При большинстве заболеваний обнаруживаются сотни различных ВХР. Пишь около 200 000 ЯЫР встречаются относительно часто, но практически все распространенные генетические заболевания связаны с теми ЯХР, что входят в их число. Обнаружить ВХР позволяет секвенирование.
Для быстрого анализа такого полиморфизма применяют новые технологии, основанные на ДНК-микрочипах. 25.10. ДНК-чипы Для быстрого и недорогого определения генетических характеристик индивида, в частности, для обнаружения генетических маркеров специфических заболеваний, учеными были разработаны новые технологии. Эти технологии основаны на использовании ДНК-микрочипов. Их применяют при анализе генетических образцов для поиска определенных последовательностей ДНК, например, ЯНР. Действие ДНК-чипов основано на том факте, что комплементарные нити ДНК слипаются друг с другом.
Однонитевые участки ДНК с известной последовательностью готовят путем денатурации, а затем наносят на микроскопическую матрицу, причем во всех точках матрицы нуклеотидные последовательности различны. Далее на каждую точку наносят исследуемый образец. Там, где анализируемая последовательность встречается с комплементарной ей последовательностью, происходит их слипание (гибридизация). В систему добавляют флуоресцентные маркеры, которые связываются только с двунитевыми участками ДНК. По наличию флуоресценции этим методом можно сразу определить неизвестную последовательность на основании той последовательности, с которой она связалась. На микроскопическую решетку размером всего несколько сантиметров можно нанести сотни тысяч различных последовательностей ДНК.
Такие ДНК-чипы производятся и продаются коммерческими фирмами. Кроме того, можно приобрести и ручные анализаторы, позволяющие одновременно анализировать до 100 образцов (и ичя. папойеп.сош). Анализ ЗМР Идентификация ЯХР, которые могут быть связаны со специфическими заболеваниями, в будущем станет важным элементом медицинской диагностики, профилактики и лечения этих заболеваний. В подобных исследованиях ключевую роль может сыграть использование ДНК-чипов. Для этого необходимо создать чипы, содержащие такие варианты генов, о которых известно, что они являются причиной заболеваний. ДНК пациента амплифицируют методом ПЦР, наносят на чип, а затем с помощью светящейся метки определяют тот вариант гена, которым обладает пациент.
Пациенту можно назначать различные лекарственные препараты, чтобы найти среди них тот, который способен ингибировать экспрессию дефектного варианта гена. Например, ДНК-чипы можно использовать для поиска мутаций в генах ВКСА1 и ВВ.СА2, которые в 60% случаев ответственны за возникновение на- 335 25.11. ЭСКИЗ ГЕНОМА ЧЕЛОВЕКА следственного рака молочных желез и яичников. При этом применяют ДНК-чипы с фрагментами нормального гена ВКСА1. Контрольную ДНК, не содержащую мутаций, и образец ДНК из крови пациентки денатурируют, получая тем самым однонитевую ДНК, которую затем расщепляют на более мелкие фрагменты и метят флуоресцентными маркерами.
ДНК пациентки помечают, к примеру, зеленым маркером, а контрольную ДНК вЂ” красным. Оба набора фрагментов наносят на чип и осуществляют гибридизацию с фрагментами гена ВКСА1. Если ген пациентки не содержит мутаций, он должен гибридизоваться с теми же фрагментами ВКСА1, что и контрольный образец (образец ДНК пациентки идентифицируют по зеленому свечению, а стандартный образец — по красному). Однако, если ген пациентки мутнрован, фрагмент ее ДНК, несущий мутацию, гибридизоваться не будет. Профиль экспрессии Экспрессию генов анализируют по связыванию мРНК на ДНК-чипах. Это осуществляется через транскрипцию последовательности гена ДНК в комплементарную копию матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК).
Далее с помощью ферментов в рибосоме последовательность РНК транслируется в аминокислотную последовательность,из которой строится определенный белок. Реакцию клетки на определенные стимулы, например, на действие токсина можно оценить, определяя их влияние на экспрессию генов, а именно, активируют они экспрессию или подавляют. Характер (профиль) экспрессии, кроме того, используют для классификации различных видов рака и других заболеваний. Для этого сравнивают профиль экспрессии генов у пациентов с известным типом заболевания с последовательностями мРНК новых больных. В таких случаях известные последовательности РНК, связанные с тем или иным типом заболевания, наносят на чипы в качестве матрицы. Анализ профиля экспрессии в дальнейшем будет играть очень важную роль для классификации различных типов рака на основании активности генов в опухолевых клетках.
Это поможет развитию специального лечения, направленного против конкретного типа рака, а также позволит найти более эффективный способ терапии в каждом отдельном случае заболевания. 25.11. Эскиз генома человека Составление «чернового варианта» генома человека осуществила группа лабораторий, выполнявших секвенирование и получивших множество перекрывающихся данных.
Всего было определено свыше 22 млрд оснований, что в семь раз превышает саму последовательность генома (т. е. можно сказать, что геном просеквенировали семь раз). В состав перекрывающихся фрагментов входит 3,9 млрд оснований. Более 30'.4 «чернового варианта» определено окончательно, т. е. с высокой точностью (8 — 10-кратное перекрывание и точность 99,9'Ъ). В практиче- ГЛАВА 26. ВЕК ГЕНО — ГЕНОМИКА И ПгОТЕОМИКА; СЕКВЕНИРОВАНИЕДНК И АНАЛИЗ БЕЛКОВ 336 ски полностью определенной части генома (89'/о целого генома) есть лишь небольшое количество пробелов. Работы по завершению секвеннровання оставшихся частей продолжаются сейчас. 25Л 2.
Геномика и протеомика: завершение рассказа Основной единицей любой живой системы является клетка. Находящаяся в ядре ДНК представляет собой инструкцию, руководящую деятельностью клетки, главным образом, через синтез белков. Большинство жизненных функций осуществляют именно белки, причем часто в виде комплексов. Для понимания функций белков, в том числе их роли в развитии различных заболеваний, и для создания лекарств необходимо изучать экспрессию генов, приводящую к образованию белков, а также структуру и функции белков.
В подобных исследованиях широко применяют аналитические методы и приборы. Геномика как наука изучает ДНК и принципы кодирования белков. Протеомика, в свою очередь, изучает клеточные белки — весь белковый состав клетки, ткани или организма (протеома), а также включает анализ белковых взаимодействий и секвенирование белков для определения их первичной структуры. Белки — это крупные молекулы, состоящие из 20 основных типов аминокислот (см, гл, 20 и 21).
Последовательность нескольких связанных между собой аминокислот называют полипептидом. Аминокислоты связываются друг с другом в результате протекания реакции конденсации между карбоксильными и О Н аминогруппами, посредством образования пептидной К' ~ связи. Синтез — С вЂ” Х— белков из аминокислот закодирован в генах. Последовательность трех оснований ДНК (называемая колоном) определяет специфическую аминокислоту и управляет процессом синтеза пептидной цепи. Например, нуклеотидная последовательность АТО кодирует аминокислоту метионин. Ген среднего размера содержит около 3000 оснований, т.
е. 1000 кодонов. Следовательно, закодированный в таком гене белок состоит из 1000 аминокислот. В этом суть генетического кода: определенный набор кодонов управляет синтезом специфического белка. Аминокислотная последовательность каждого белка заставляет его образовывать специфическую трехмерную структуру, которая очень важна для функционирования белка в клетке (рис.
25.11). Закодированная в генах информация передается путем образования комплементарной однонитевой матричной рибонуклеиновой кислоты (мРНК) в процессе, называемом транскрипцией. Молекулы мРНК выходят из ядра в цитоплазму, где становятся матрицей для синтеза белка. Выше мы описали подходы к изучению экспрессии генов с применением ДНК-чипов, а также возможности использования полученной информации для идентификации генетических мутаций, ответственных за те или иные заболевания.
Область протеомики распространяется еше дальше — на получение информации о структуре белков. Существуют мощные методы, позволяющие разделять и исследовать белки в смесях. 338 П|АВА 25. ВЕК ГЕНО — ГЕНОМИКА И ПРОТЕОМИКА СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДИК И АНАЛИЗ БЕЛКОВ РИС. 25.12 Лвумсрныи гель-злекзрофорсз Гвоспроизвелено с разрешения аоь-н Мйс Оопп. Росшпаль Харефилдз, Мндалсеас, 339 ж12.
ГенОмикА и ОРОтеОмикА: 3АВеРшение РАсскАВА кацию. Образец пептида смешивают с очень большим избытком матричного материала, в качестве которого применяют небольшие поглощающие в УФ-диапазоне органические молекулы (например, дигидроксибензойную кислоту), а затем смесь высушивают на твердой подложке, создавая кристаллическую матрицу. Матрицы поглощают свет на длине волны азотного лазера (377 нм) и превращают его в теплоту, что приводит к испарению и ионизации образца, при которой пептид протонируется, приобретая заряд +1. Образующийся пар подается на детектор с помошью электростатических линз. Метод МАЬЕИ не только обеспечивает возможность регистрации отдельного пика для каждого иона, но и характеризуется высокой чувствительностью.
Для получения хорошего масс- спектра достаточно фемтомолярных (10-м) количеств образца. Время-пролетный детектор ТОР представляет собой простейший масс-анализатор. Он позволяет определить отношение т1з для ионов путем измерения времени, необходимого ионам для преодоления фиксированного участка пути до детектора. Все ионы, попадаюшие в анализатор, имеют одинаковую кинетическую энергию, но скорость их движения зависит от массы, поэтому они достигают детектора через разные промежутки времени. Идентификация белков В результате обработки трипсином белки расщепляются на смесь различных полипептидов длиной, скажем, от 4 до 20 аминокислотных остатков.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
