Г. Кристиан - Аналитическая химия, том 2 (1108738), страница 59
Текст из файла (страница 59)
Обычно для приготовления образцов цельной крови или плазмы необходимое количество раствора оксалата помещают в пробирки, а затем высушивают в печи при 110 'С; это позволяет избежать разбавления образца крови. Например, для препарата крови объемом 10 мл необходимо взять (и высушить) 0,5 мл 2;4 -го раствора оксалата калия. Под действием оксалата калия эритроциты сжимаются, так что внутриклеточная вода переходит в плазму, поэтому плазму необходимо отделить от клеток как можно быстрее.
Если образец необходимо хранить в анаэробных условиях, как при определении содержания СО, в пробирку для отбора пробы добавляют минеральное масло, которое легче крови и распределяется на поверхности образца. Пробирки с такими образцами закрывают корковыми пробками, поскольку резиновые пробки в минеральном масле разбухают. Иногда к образцам вместе с антикоагулянтом добавляют консервант. Если необходимо определить содержание глюкозы, то в качестве консерванта часто используют фторид натрия.
Это вещество является ингибитором активности ферментов, вызывающих разложение глюкозы (гликолиз). На 1 мл крови достаточно добавить 1 мг фторида натрия. Поскольку фторид натрия ингнбирует и другие ферменты, в том числе уреазу, его не следует добавлять к тем образцам, в которых предстоит определять активность ферментов илн содержание мочевнны с помощью уреазы.
Обычно образцы можно хранить в охлажденном виде один илн два дня. Охлаждение замедляет ферментативные и микробные процессы, но не останавливает их, поэтому лучше анализировать пробы как можно быстрее после их отбора. Перед проведением анализа образцы необходимо довести до комнатной температуры. Заморозка позволяет сохранять образцы длительное время, поскольку останавливает ферментативную акпвность в крови.
Цельную кровь не следует замораживать, поскольку при этом разрушаются эритроциты. При заморозке образцы сыворотки и плазмы расслаиваются, образуя участки с разным содержанием компонентов, так что после размораживания их необходимо осторожно перемешать. 303 24тя НЕКОТОРЫЕ РАСПРОСТРАНЕННЫЕ МЕТОДИКИ Образец является более устойчивым, если приготавливается безбелковый фильтрат (ББФ). Его используют для предотвращения влияния белков на результаты анализа.
В соответствии с методом Фолина — Ву или методом с применением вольфрамовой кислоты один объем крови, сыворотки или плазмы смешивают с семью объемами воды и одним объемом О,ЗЗ М серной кислоты н оставляют до появления коричневой окраски. Затем добавляют один объем 1',4-го (масса: объем) раствора вольфрамата натрия Наг%04 .
2НзО, а спустя 2 мин смесь фильтруют или центрифугируют, отделяя выпавший в осадок белок. В методе с применением трихлоруксусной кислоты (ТХУК) один объем крови, сыворотки или плазмы смешивают с девятью обьемами 5'Ъ-го раствора ТХУК (масса: объем), а после осаждения белков смесь фильтруют или центрифугируют.
В обоих случаях получается кислый фильтрат, но он пригоден для определения многих веществ. Если полученные данными методами фнльтраты использовать для определения глюкозы путем ее окисления (например, с помощью тартрата меди, см. ниже), то результаты могут быль завышены. Этой проблемы можно избежать, если приготовить безбелковый фильтрат с помощью гидроксида бария и сульфата цинка, поскольку из него будет удалено большинство мешающих восстановителей (см, практическую работу 35). В данном случае безбелковый фильтрат является практически нейтральным, поскольку образующийся сп(ОН)з выпадает в осадок: Ва(ОН) + УлЯО -+ ВаЯО + сп(ОН) з В безбелковом фильтрате глюкоза не разлагается, поскольку гликолитические ферменты из него удалены. 24.3.
Некоторые распространенные методики в клиническом анализе Наиболее часто определяемые вещества в практике клинического анализа с указанием методик их определения приведены в табл. 24.2, Однако следует иметь в виду, что во многих случаях существует несколько вариантов определений, и выбор конкретной методики определяется степенью применимости, скоростью, чувствительностью, точностью и другими факторами.
Основные электролиты сыворотки — натрий, калий, кальций, магний, хлорнды и бикарбонат (СОз) — определить довольно легко. Металлы проще всего определить методами пламенной спектрометрии или атомной абсорбции, а для определения кальция и магния существуют еще и фотометрические методы. Кальций и, реже, магний, кроме того, титруют раствором ЭДТА.
Для рутинного определения натрия, калия и кальция применяют ионселективные электроды. Бикарбонат определяют как манометрическим методом, так и путем обратного титрования стандартным раствором кислоты (см, практическую работу 8). Хлориды часто определяют с помощью автоматического кулонометрнческого титрования с электрогенерацией ионов серебра. 304 ГЛАВА 24. КЛИНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ Пожалуй, наиболее часто в клинической практике определяют уровень глюкозы н азота мочевины (В(ЛЧ) в крови. В соответствии с методикой проведения анализа на содержание глюкозы, приведенной в табл. 24.2, определяют сумму всех восстанавливающих сахаров, поэтому результаты могут быть завышены. Однако эти методы используются в качестве стандартных на протяжении уже многих лет.
Существует также ферментатнвный метод определения глюкозы (см. гл. 22), для проведения которого широко применяются специальные анализаторы. Определяемое вещество Анализируемый образец' Методика измерения Основы Спектрофотометрия (фермент.) Азот мочевины К (В1ЛЧ) Азот небелковый ()ЧР)ч) Спектрофотометрия К УФ-спектрофотометрия Барбитураты С Белок общий С Спектрофотометрия Железо С Спектрофотометрия Иод белково- С связанный Спектрофотометрия (каталнт.) (БСИ) Калий Пламенная фотометрия; электрод Кальций Атомно-абсорбционная спектроскопия Таблица 24.2 (начало) Некоторые методы клинического анализа ББФ (с вольфрамовой кислотой) инкубируют с уриазой при рН 6,8; образующийся !ЧН определяют с реактивом Несслера ББФ гидролизуют до образования )ЧН4Н804, добавляют ноднд ртути (реактив Несслера) лля связывания аммиака и измеряют поглощение при 480 нм Барбитураты экстрагируют СНС1, затем раствором )ЧаОН; измеряют поглощение в щелочной среде при 252 нм Тартрат меди образует комплекс с белками (биуретовая реакция); поглощение измеряют через 30 мин при 550 нм Железо в ББФ восстанавливают до Ре(11) и добавляют батофенавтролнн; поглощение измеряют при 535 нм Белки осаясцают ТХУК, озоляют или гидролизуют; через 20 мин измеряют каталитическое действие иона 1 на скорость превращений Се(1Ч) — Аз(1П) по поглощению Се(!Ч) при 420 нм Разбавляют (1: 50) 0,15 М )ЧаС! и измеряют поглощение при 766 нм; К+ ИСЭ Разбавляют (1: 20) !Ча ЭДТА (10 000 ррщ) и измеряют поглощение при 422,7 нм ЗОВ Определяемое вещество Основы Спектрофотометрия Креатинин С Магний Атомно-абсорбционная спектроскопия Спекгрофотометрия Мочевая кислота С Пламенная фотометрия; Разбавляют(1: 50) и измеряют электрод поглощение при 589 нм; На' ИСЭ Натрий С Салицилат С Спеятрофотометрия Спектрофотометрия Сахар (глюкоза) К или С Углекислый газ С Манометрия; электрод Фосфатаза кислая С Спекгрофотометрия Фосфатаза С щелочная Спектрофотометрия Фосфор С неорганический Спекгрофотометрия Хлориды С Волюметрия; кулонометрия ' С вЂ” сыворотка; К вЂ” кровь.
24.3. НЕКОТОРЫЕ РАСПРОСТРАНЕННЫЕ МЕТОДИКИ Таблица 24.2 (окончание) Некоторые методы клинического анализа Анализируемый образец' Методика измерения ББФ (ТХУК) реагирует с щелочным пикратом; поглощение измеряют при 490 нм Разбавляют (1: 20) 1% )ь(а ЭДТА н измериот поглощение при 285,2 нм ББФ (с вольфрамовой кислотой); окисляют щелочным раствором фосфовольфрамата и измеряют поглощение синего продукта при 680 нм Образует комплекс с нитратом железа(1П) в кислой среде; поглощение измеряют при 535 нм БФФ (Ва(ОН) -ЕпБО ); в реакции с Сц(П) образуется Сц О, который восстанавливает фосфомолибденовую кислоту с образованием молибденовой сини, определяемой при 420 нм; после проведения реакции сахаров с о-толуидином измеряют поглощение при 635 нм Метод Ван Спайка; электрод на СО Инкубируют 1 ч с глицеро- фосфатом натрия при рН 4,9; образующийся фосфат определяют, как и в случае неорганического фосфора Как н в случае кислой фосфатазы, но инкубируют при рН 9,6 БФФ (ТХУК); при взаимодействии с Мо(!Ч) образуется фосфомолибденовая кислота, которую далее восстанавливают до молибденовой сини и измеряют поглощение при 660 нм Титруют с Ай" или Нй(П) ГЛАВА 24.
КЛИНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ Более селективное определение мочевой кислоты осуществляют с помощью ферментативной методики, отличной от указанной в табл. 24.2. В аликвоте образца мочевую кислоту разлагают с помощью фермента уриказы и измеряют поглошение синего продукта восстановления фосфовольфрамата. Вторая аликвота служит в качестве раствора контрольного опыта.
Кроме того, мочевую кислоту можно определить непосредственно по поглощению в ультрафиолетовой области при 290 нм до и после инкубации с уриказой. Альбумин и глобулины после фракционирования высаливанием с помощью сульфата или сульфита натрия можно определить тем же методом, который используют для определения общего содержания белка. Иногда требуется более подробная информация о содержании отдельных белковых фракций (а-, 13- и у-глобулинов). В таком случае для их разделения может подойти электрофорез в крахмальном геле.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
