Г. Кристиан - Аналитическая химия, том 2 (1108738), страница 63
Текст из файла (страница 63)
Результаты, полученные в рамках основного проекта, открыты для широкого доступа. По соглашению с журналом Яс1епсе Селера поместила свои результаты в собственную базу данных. Этими данными может пользоваться любой желающий, но не в коммерческих целях. В реальности опубликованные «предварительные результаты» были закончены лишь на 89'.4, а полное завершение Проекта потребовало более трех лет работы.
Каковы же основные открытия, полученные при реализации Проекта? Одним из наиболее удивительных результатов оказалось то, что лишь 30 — 35 тыс. генов (158 генома) кодируют белки. (В соответствии с накапливающимися данными эта цифра у приматов, возможно, окажется выше.) Это в два с лишним раза меньше, чем ранее называвшаяся цифра 80 — 100 тыс.
генов. Большую часть генома составляют длинные повторы некодирующих участков ДНК. Одна четвертая часть генома представляет собой длинные участки, вообще не содержащие генов. Такая сложная организация стала одной из проблем при анализе генов. 25 4. КАК ОСУЩЕСТВЛЯЕТСЯ СЕКВЕНИРОВАНИЕ ГЕНОВ? З2В 25.4. Как осуществляется секвенирование генов? * Секвенирование преггставляет собой сложный, но теггерь уже рутинный процесс. На рнс. 25.7 и 25.8 отражены его основные сталин, которые подробнее описаны ниже. Секвенируя перекрывакчциеся послеловзгельногти,грнов воггозлаье? 326 ГЛАВА 25. ВЕК ГЕНО — ГЕНОМИКА И ПРОТЕОМИКА; СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК И АНАЛИЗ БЕЛКОВ гид находится на конце каждого фрагмента — А, Т, б или С.
Если среди миллионов или миллиардов клонированных фрагментов мы получим фрагменты всех возможных длин, и если нам удастся разделить их по длине и выстроить в линию, мы как раз получим полный упорядоченный набор нуклеотидов, соответствующий исходной матрице ДНК. Представьте себе, что мы выделили набор следующих фрагментов, заканчивающихся указанными нуклеотидами: Т А А Это означает, что исходная матрица ДНК имела последовательность ТААСб. Далее мы обсудим, как это можно сделать. 25.5. Амплификация ДНК: полимеразная цепная реакция ДНК обладает уникальным свойством; при нагревании она денатурирует (легче, чем белок), причем этот процесс заключается в расхождении двух ее нитей.
Это происходит при нагревании раствора ДНК до критической температуры. Разошедшиеся нити ДНК по-прежнему комплементарны друг другу, так что при охлаждении раствора за счет беспорядочного движения молекул они вновь слипаются, образуя двухцепочечную ДНК. Данный процесс называют отжигом, или гибридизацией. Для секвенирования и анализа ДНК необходимо получить достаточно большой участок ДНК, т. е. амплифицировать фрагменты. Воспроизвести каждую отдельную нить ДНК можно с помощью фермента ДНК-полимеразы в присутствии набора четырех нуклеотидов и праймера. Праймер — это короткий участок ДНК (олигонуклеотид, обычно состоящий из 20 пар нуклеотидов — п.
н.). Последовательность праймера комплементарна одному из концов амплифицируемой матрицы ДНК, так что он способен с ней слипаться. Вот пример типичного праймера, состоящего из 20 п. н.: 5'-АТТ-ААС-ССТ-САС-ТАА-Абб-бА-3'. ДНК-полимераза достраивает праймер, создавая при этом нить, комплементарную матрице ДНК, так что роль праймера заключается в инициации полимеразной реакции. Фермент достраивает 3'-конец праймера. Он «прочитывает» каждое основание в однонитевой матрице ДНК и пристраивает к праймеру соответствующее комплементарное основание гнапример, если в матрице стоит Т, то фермент присоединяет А, если стоит С вЂ” то б и т.
д.) Фермент продвигается вдоль матрицы и при этом создает точную комплементарную последователь- 327 26.6. ПЛАЗМИДЫ И ИСОССТВЕННЫЕ БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ХРОМОСОМЫ ность (для нити 5' — +3' получается комплементарная нить 3'-+5'). Одновременно то же самое происходит и со второй нитью расплетенной исходной молекулы ДНК. Так происходит удвоение числа молекул ДНК. Процесс повторяют, многократно повышая и снижая температуру, пока не получат достаточное количество ДНК; в каждом цикле число молекул ДНК удваивается. Таким образом из единственной копии ДНК можно получить миллиард реплик. Данный процесс называют полимеразной цепной реакцией (ПЦР).
Существует несколько типов полимераз. Для ПЦР обычно применяют Тас(- полимеразу, которая выделена из термофильной бактерии Тузегторйгтгл адиаггс сил и стабильна при высокой температуре. С помощью полимеразной цепной реакции можно обнаружить чрезвычайно малые количества ДНК, причем даже в смесях, что очень удобно для проведения судебно-медицинской экспертизы и в клинической диагностике. Например, в деле О. Дж.
Симпсона ПЦР использовали для амплификации ДНК из следов крови, найденных на месте преступления. ДНК, полученную методом ПЦР, далее секвенируют, как описано ниже, а затем найденную последовательность нуклеотидов сравнивают с последовательностью ДНК подозреваемого. 25.6. Плазмиды и искусственные бактериальные хромосомы При выполнении проекта креном человека» библиотеки, содержащие крупные клонированные фрагменты геномной ДНК, собирали и секвенировали. Клонирование основано на естественной способности ДНК к репликации. Для репликации фрагментов геномной ДНК используют разные вспомогательные молекулы ДНК, называемые векторами. Существует два основных типа векторов — плазмиды и искусственные бактериальные хромосомы (Ьасгена1 агбйсга1 сьгопюзогпез, ВАС).
Плазм иды Плазмиды — это маленькие кольцевые молекулы ДНК, обнаруженные в некоторых бактериях. Плазмиды удается выделять в больших количествах. Выделенные плазмиды разрезают и встраивают в них последовательность ДНК, которую предстоит анализировать. Встроенную последовательность ДНК называют вставкой. Плазмиды, содержащие вставку, вновь переносят в бактерии; бактерии начинают реплицировать плазмиды наряду со своей собственной ДНК, производя миллиарды копий, которые затем вновь выделяют. Обычно последовательность вектора известна, а вот последовательность вставки предстоит В середине ) 990-х годов суд Лос-Анджелеса рассматривал дело знаменитого американского футболиста О. Дж.
Симпсона, обвинявшегося в убийстве своей бывшей жены и ее приятеля. Кровь жертв нашли на его одежде, обнаруженной вдоме и в машине. ДНК-экспертиза установила идентичность этих образцов и крови самого Симпсона. Однако суд не принял результаты ДНК-экпертизы как доказательство вины Симпсона, поскольку в ходе следствия и экспертизы были выявлены явные ошибки. Симпсон бьш оправдан криминальным судом (позднее дело передали в гражданский суд, который присудил его к выплате огромной компенсации).
— Прим. перев. 328 ГЛАВА 25. ВЕК ГЕНО — ГЕНОГАИКА И ПРОТЕОМИКА' СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК И АНАЛИЗ БЕЛКОВ ныясиизь. Среди часзо используеГиыл плазмпд можно зпсзвась РОЕМ, рВР322 и рГ::С18. 1!лазмидлая ДНЕ имее~ сравнизельзю небольшой размер -- оз 2000 до 20000 п. и. 329 25.7. СЕКЕЕНИРОВАНИЕ ДНК 25.7. Секвенирование ДНК Итак, получены ра с|аниме фрагменты геномной Д) )К, готовые для сеьаенировання. 'тти фрагменты имеют разную Ллииу и оерекрывакисч. г)тобы ссютавить оон)ую картину, следу ее иросеквенировать каждый из нот а ъпем выгтолн1ь лк 330 ГЛАВА 25.
ВЕК ГЕНО — ГЕНОМИКА И ПРОТЕОМИКА; СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК И АНАЛИЗ БЕЛКОВ Более короткие фрагменты пвижупся в геле быстрее ллннпых и тлюируктгся первыми. Г!ервый и второй фрагменты в рассмотренном примере, счи гая сингу, разделены двумя лругими Гфрагментов соответствутоптей панны. заканчивали и[икса на Ап не существус~1, а два верхних - еще одним. В реальное Гп всегда нме)от пело со смесью фпагмекп оп, заканчиваклщихся 332 П!АВА 25 ВЕК ГЕНОВ - ГЕНОМИКА И ЛРОТЕОМИКА: СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК И АНАЛИЗ БЕЛКОВ ный фонд и 11ациональный институт здоровья (США) финансировали работу по созданию ВАЕГ-библиотек.
!!абораторип-у ыстннцы Проекта амплифицировали библиотеки и осузцествляли секвенирование, используя метод дробления. Е1е утлубляясь в подробности. секвенирование дроблением заклю лзлось в следунпцем: лаборатории, проволивснис секвенирование, получали клоны из 253, ПОЛИМОРФИЗМ ОТДЕЛЬНЫХ НУКЛЕОТИДОВ 333 Секвенирование генома методом дробления 25.8. Участники альтернативной группы Селера предприняли несколько другой подход. Они опустили стадию создания ВАС-библиотек, содержащих длинные последовательности ДНК, сразу разбивая геном на фрагменты размером 2000 — 10000 п.
н. и секвенируя каждый из иих кусками по 700 нуклеотидов (максимальное количество нуклеотидов, которое можно прочесть за один проход). Поскольку в целом речь идет о трех миллиардах оснований, то после секвенирования необходимо рассортировать и расставить по местам огромное количество фрагментов (на самом деле, лишь часть фрагментов подвергалась сортировке, но и это число крайне велико). Для такой работы потребовались очень мощные компьютеры.
Для более быстрой сортировки миллионов фрагментов всю процедуру выполняли автоматически, осуществляя разделение с помощью капиллярного элекгрофореза, разрешение которого выше, а скорость больше, чем у гель-электрофореза. Детекцию проводили, пропуская луч лазера через капли на концах множества капилляров. Основная исследовательская группа, выполнявшая Проект, также в значительной степени переключилась на такой принцип работы (с использованием анализатора АВ1 модель 3700).
Ученые расходятся во мнениях относительно того, какой подход обеспечивает получение более точных результатов. Обе группы продолжают работу по анализу оставшихся непрочитанными участков (вспомните, что сначала удалось прочесть лишь 89',4 генома). 25.9. Полиморфизм отдельных нуклеотидов Раскодирование человеческого генома выявило удивительное сходство генетического строения всех людей (на самом деле, наш генетический код не слишком отличается и от кода животных). Около 99,998 генов у всех людей одинаковы, и лишь 0,198 генов отвечают за те различия, которые между нами существуют. Кроме того, среди этих 0,1'.4 генов содержатся те, что ответственны за возникновение болезней и нарушение функций организма.
Обычно эти гены различаются всего на одно основание. Конечно, О,1 ~ от 3 миллиардов дает все же значительную цифру — 3 миллиона генов. Однако существуют генетические маркеры, которые сужают область поиска таких генов; это так называемые ЯЛ1Р (ап81е-ппс1еоййе ро!упюгрйяпз, «спины»). По оценкам специалистов около 80-90;4 вариаций генома человека связано с ЯНР. Поиск БХР представляет собой быстро развивающуюся область исследований в клинической и фармакогенетической практике, поскольку позволяет идентифицировать генетические дефекты и создать лекарства для борьбы с ними.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
