Г. Кристиан - Аналитическая химия, том 2 (1108738), страница 61
Текст из файла (страница 61)
Принцип конкурентного связывания, используемый в иммунологических методах анализа, может быть применен и в других аналитических системах. С помощью принципа конкурентного белкового связывания, можно детектировать любое вещество, способное специфическим образом связываться с определенной макромолекулой. В качестве специфической макромолекулы может выступать белок сыворотки, например, тироксинсвязываю!ций глобулин, специфический рецептор или антитело. з1з 24.4. ИММУНОАНАЛИЗ Специфичность иммуноанализа Использующаяся для иммуноанализа антисыворотка никогда не может быть абсолютно специфична к определенному антигену.
На специфичность анализа оказывает влияние: а) гетерогенность антител; б) перекрестные реакции с другими антигенами; в) присутствие низкомолекулярных веществ, способных влиять на реакцию между антителами и антигенами посредством изменения условий среды. Конкретный антиген приводит к образованию целого набора антител н взаимодействует с ними в различной степени, в зависимости от константы равновесия соответствующей реакции. Кроме того, в одном типе антител могут встречаться антитела с различным числом и расположением участков связывания.
Проблему гетерогенности удалось уменьшить с развитием технологий очистки антисыворотки. Кроме того, синтетические моноклональные (т. е. однотипные) антитела обеспечивают очень высокую специфичность анализа. Проблема перекрестных реакций с другими антигенами довольно сложна и должна рассматриваться отдельно для каждого типа определяемого антигена. Для решения этой проблемы могут потребоваться специальные методы очистки. Среди неспецифических факторов, влияющих на скорость реакции между антителами и антигенами, можно назвать рН, ионную силу, повышенную температуру, состав инкубационной среды, наличие гепарина, мочевины и высокой концентрации билирубина.
Стандартные и анализируемые образцы антигенов необходимо разводить в не содержащей антигенов плазме, чтобы избежать различий в составе среды, а также использовать один и тот же буфер или раствор для разведения. Если не содержащая антигенов плазма, принадлежащая организму того же вида, недоступна, можно применять плазму другого вида, использование которой исключает возможность возникновения перекрестных реакций. Получение антител Естественно, что для проведения иммуноанализа требуется подходящая антисыворотка. Важно учитывать концентрацию антител в сыворотке (так называемый титр антител*), но главным критерием при выборе антисыворотки является ее специфичность и аффинность по отношению к анализируемому антигену.
Обычно для получения антител животным вводят от 0,2 до 2,0 мг чистого антигена, смешанного с адъювантом Фрейнда (комбинация минерального масла, воска и убитых бактерий, которая усиливает и продлевает иммунный ответ). Для получения антител используют кроликов, овец, морских свинок, коз, кур или обезьян — в зависимости от необходимого объема антисыворотки и степени допустимой побочной активности антигена. Небольшие молекулы с относительной молекулярной массой 1000-5000 (небольшие полипептиды, стероиды и др.), называемые га тенами, самостоятельно не могут вызывать иммунный ответ.
Поэтому перед инъекцией животным гаптены связывают с более крупными молекулами — носителями, в качестве которых применяют белки или синтетические вещества. Часто в роли носителей Это понятие имеет другой смысл, в отличие от титра, о котором идет речь в гл. 5. ГЛАВА 24. КЛИНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ 314 выступают человеческие гаммаглобулин или альбумин, синтетические пептиды и полимеры. Вводить антиген иммунизированному животному можно несколько раз, получая при этом разные серии сыворотки.
Для большинства видов анализа, для которых получены меченые антигены, существуют коммерческие препараты антисыворотки. Разбавленные образцы сыворотки можно хранить длительное время в замороженном виде. После размораживания препараты хранят при 4 'С. Длительность периода инкубации Время до наступления равновесия в реакции между антигеном и антителом в процессе анализа составляет от нескольких часов до нескольких суток в зависимости от свойств определяемого антигена. Длительная инкубацня обычно нежелательна, поскольку антиген может повреждаться при продолжительном воздействии высококонцентрнрованных белков плазмы, окислителей и др., так н не достигнув состояния равновесия.
Разделение связанного и свободного антигена Существуют различные методы разделения свободного и связанного антигена после инкубации для последующего определения доли связанного антигена с помощью метки. (Стоит отметить, что это актуально в гетерогенном типе анализа. При проведении анализа гомогенного типа (см. ниже) разделения не требуется.) Иммунные комплексные соединения (комплексы антиген — антитело) представляют собой белоксодержащне вещества, которые можно осадить (денатурировать) добавлением большого количества соли (например, (НН4)зб04, )Чазб04) или органического растворителя (ацетона„этанола н др.) Осаждение используется чаще, при этом выпавший в осадок комплекс отделяют центрифугированием (хотя можно и фильтрацией), а затем анализируют количество метки в одной или обеих фракциях.
Кроме того, широко применяется метод с вторичными аитителами, которые используют для осаждения комплекса, образованного антигенами и первичными антителами. Вторичные антитела получают путем введения второму животному гаммаглобулина, образовавшегося в крови первого животного, которое использовалось для получения первичных антител. Несмотря на то, что еще один тип антител является дополнительным источником погрешностей, данный метод имеет то преимущество, что может применяться практически в любом типе иммуноанализа и сопровождается полным разделением свободного и связанного антигена.
К другим методам разделения относятся электрофорез (см. гл. 21) и иммобнлизация антнгенов или антител на твердой подложке. Иммуноанализ с флуоресцентной меткой Если антитела или антигены помечены флуоресцентным красителем, то детектирование основано на измерении флуоресценции 1121. Данный тип анализа 24.4. ИММУНОАНАЛИЗ получил широкое распространение, поскольку с химическими веществами обращаться гораздо проще, чем с радиоактивной меткой, и отсутствует проблема распада метки. Наиболее известными флуоресцентными красителями являются флуоресцеин изотиоцианат (ФИТЦ) и лиссамин родамин (КВ200).
Обычно для конъюгации с красителем (мечения) используют смесь иммуноглобулинов, которые не должны содержать примеси других сывороточных белков, поскольку альбумин и другие глобулины метятся легче, чем гаммаглобулин, в результате чего метод теряет свою специфичность. После конъюгации непрореагировавший краситель удаляют, а меченый белок очищают методом эксклюзионной хроматографии.
Флуоресценция меченого антигена часто гасится в процессе иммунохимической реакции, причем снижение интенсивности флуоресценции можно измерить без проведения физического разделения. В этом состоит отличие анализа гомогенного типа от анализа гетерогенного типа, при котором требуется разделение реакционной смеси. Иммуноанализ с ферментативной меткой В качестве метки используют ферменты, например, пероксидазу; количество непрореагировавшего антнгена, связанного с ферментом, определяют с помощью соответствующей ферментативной реакции.
Опять же здесь активность фермента часто ингибируется в результате протекания иммунохимической реакции, поэтому снижение активности можно применять как количественную меру при проведении гомогенного иммунохимнческого анализа. Иммуноанализ с ферментативной меткой в гомогенной системе часто используют для определенна низкомолекулярных веществ, таких как дигоксин, амфетамины и лекарственные средства, отпускаемые по рецепту. Распространенной разновидностью ферментативного метода иммуноанализа является так называемый твердофазный иммуноферментный анализ (епхуше-!1пкед пппшпозогЬеп1 аззауз — ЕЫЯА) [131.
Некоторые варианты данного метода проиллюстрированы на рис. 24.7. В данном случае антитела или антигены иммобилизуют на твердой поверхности, такой как стекло или пластик. Использование полипропиленовых или полистирольных пробирок или дисков, обладающих адсорбирующей поверхностью, позволяет избежать стадию центрифугирования. Такие поверхности легко моются и адсорбируют воспроизводимое количество антигенов или антител.
Обычно используют пластиковые, чаще всего 96-луночные планшеты, позволяющие одновременно анализировать множество образцов и стандартов, причем проведение анализа можно облегчить применением автоматических пипеток и измерительных устройств. Если ферментативная метка связана с антителом, то при взаимодействии антитела с определяемым антигеном ферментативная активность ингнбируется; в данном случае мы имеем дело с анализом, основанном на неконкурентном типе связывании (см., например, 1111). В конкурентном варианте ЕЫБА антитела на твердой подложке нммобилизуют с помощью гидрофобных взаимодействий. В этом случае наряду с образцом немеченого антигена в клиническая химия 316 Ат — Е ч- Аг -+ Аг — Ат — Е Анализ основан на неконкурентном связывании фермента.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
