Г. Кристиан - Аналитическая химия, том 2 (1108738), страница 62
Текст из файла (страница 62)
Е ингибируется при связывании. 1 — Ат ь Аг — Е 1 — Ат — Аг Аг 1 — Ат — АгЕ Конкурентный метод Е1,! ЯА. Количество связанного Аг-Е снижается по мере роста Аг. 1 — Ат-ьАг-+ 1 — Ат — Аг ~ — Ат — Аг + Ат — Š— + ~ — Ат — Аг — Ат — Е Неконкурентный метод «сэндвич-Е1.1БА».
Количество связанного Атн увеличивается пропор- пионально количеству Аг РИС. 24.7. Метод Е1,1БА. Аг — анализируемый антиген; Ат — антитело; Š— ферментативная метка инкубационную среду добавляют известное количество меченого ферментативной меткой антигена, и они конкурируют за участки связывания на антителах, иммобилизованных на носителе. После инкубации лунки промывают и добавляют субстрат для ферментативной реакции; обычно для этого используют ферментативные системы, в которых образуется окрашенный продукт. Наиболее сильная окраска (наибольшее количество продукта ферментативной реакции) наблюдается там, где антиген в образце отсутствовал и, следовательно, не препятствовал связыванию меченого антигена; ослабление окраски пропорционально количеству антигена в образце.
Для проведения данного типа анализа требуется довольно большое количество очищенного антигена, необходимого для предварительного мечения. Сэндвич-метод является неконкурентным вариантом иммуноанализа. В лунки с иммобилизованными антителами добавляют образец, а после инкубации— меченные ферментативной меткой антитела, которые связываются пропорционально количеству связавшегося антигена. Не связавшиеся меченые антитела вымывают, а на твердой подложке остаются своеобразные «сэндвичи» вЂ” антигены, заключенные между мечеными и немечеными антителами.
Окраска, развивающаяся в процессе ферментатнвной реакции, прямо пропорциональна количеству антигена. В косвенном варианте метода ЕЫЯА определяемый антиген сначала адсорбируют на твердой подложке либо напрямую, либо через антитела, как описано выше. Затем добавляют немеченые первичные антитела, инкубируют и отмывают. Наконец, добавляют вторичные меченые антитела (полученные про- 317 РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА тив соответствующего класса иммуноглобулинов того вида животных, от которого взяты первичные антитела), снова инкубируют и отмывают жидкую фазу. В данном случае ферментативная активность (и интенсивность окраски продукта) тоже пропорциональна количеству аитигена.
Преимуществом данного метода является возможность использования «универсального» конъюгата в качестве вторичных антител против всех первичных антител, относящихся к тому же классу иммуноглобулинов соответствующего вида животных. Таким образом, для определения каждого конкретного антигена нет необходимости метить первичные антитела.
Косвенный метод ЕЫВА обычно чувствительнее прямого метода анализа; это, по-видимому, объясняется тем, что с каждым первичным аитителом связывается несколько меченых вторичных антител. Кроме того, неконкурентные методы анализа обычно более чувствительны, чем их конкурентные аналоги. Что мы узнали из этой главы? ° Состав крови и основные измеряемые показатели (рис. 24.2, табл. 24.1 и 24.2) — стр. 300 ° Принципы иммунного анализа: антигены и антитела; флуоресцентный иммуноанализ, ферментативный иммуноанализ (ЕЫБА) — стр. 308 Вопросы 1. Перечислите основные компоненты крови. 2.
Что такое гемолиз и почему о нем нужно знать? 3. Почему к образцам крови, анализируемым на содержание глюкозы, часто добавляют фторид натрия? 4. Почему образцы цельной крови нельзя замораживать? 5. Какие наиболее распространенные виды клинического анализа? 6. Что такое антитело? 7. Объясните принципы иммуноанализа. Какие метки используют в этом методе? Какие возможные варианты этого метода вы знаете? Рекомендуемая литература Общая 1.
С. А. Впп)з апд Е. В.. АзЬв сод, е<Ь., Т1егз Гипг?атепю!з оТСДшса1 Сйетиггу, 4'" ед., %'азЬ)п8топ, 13С: Аптепсап Авяос)айоп оГС!1шса1 СЬещ)вагу, 1995. 2. С. А. Впгбз апд Е. В.. АзЬиооб, едз., Т)егг Техгбоо)г ог С!т1са1 СБети1гу, 3'~' ед., %'азмп8Гоп, ПС: Агпепсап Ааяос)айоп оГС1ш)са1 СЬет)зну„1998. З4В ГЛАНА 24. КЛИНИЧЕСКАЯ ХИМИЯ 3. М.
Кешег апд 17. ВеИ8зоп, едз., Бгапдагд Мегйодк т С11пьса1 Сйет!кггу. Кап Еь!е8о: Асадеппс. Многотомная серия, выходящая в свет с 1953 г. 4. 17. бИс1с, ед., Мегйос!к о~В!осйетгса! Апа1ук!к. Ыеьи Уог!с: %8еу-1пьегзсьепсе. Серия томов, выпускаемых ежегодно, начиная с 1954 г. 8. 17.
Б. Уопп8 апд К.. В. РПедьпап, ЕЯесг о)' В!кеакек оп С1тгса1 Еайогагогу Тек!к, 4"' ед., %азЬ)п8топ, 1ЗС: Ашепсап Аззос!аИоп оу СИшса! СЬеппзггу, 2001. 6. 17. Б. Уопп8 апд К. В. Рпедшап, Е!Тес! оТ2)ги8к оп С1тьса1 1.айогагогу Тек!к, 5в' ед., %азЬ)п8гоп, РС; Ашепсап Аззос!адоп оГ С1шьса1 СЬеш)зиу, 2000. 7. 3.
%ап8, Е!есггоапа1уиса! Тесйпи!иек т С1т!са! Сйетьгггу апд Еайогагогу Мед!с!пе. Ыеьк Уог1с ЧСН, 1988. Иммуноанализ 8. У. Т. %п, ДиапШаггьье Тттипоаккаус А Ргасаса1 би!ь!е !от Аккау Екгай!!кй- тепг, Тгоий!екйоог!п8, апс! С!!п!са! Арр!!саг!опк. %азЬ1п8ьоп, 1)С: Ашепсап Аззосьадоп оР СИшса1 СЬеппзьгу, 2000. 9. С. Р. Рпсе апд О. 3. Ыеичпап, Рппс1р1ек апг1 Ргас псе оТТттипоаккау, 2"4 ед Ваз!п8зго)се НашрзЬьге, !ьК: Маспп11ап, 1997. 1 О.
Б. А. Вегзоп апд К. 8. г'а!!оьи, «1пшшпоаззау оГР!аяпа!пзп!!п», Тттипоаккау оТНогтопек, С!Ьа г оипаь. Со!1ос!. Епдосгьпо1., 14 !1962) 182, 1 1. Т. А. Ке11у апд б. 17. СЬпздап, «Ношо8епеопз Епхушадс Р!погезсепсе 1пппп поаззау оу Веппп 18б Ьу Соп11ппопз-Р1оьи 1п)есь!оп Апа!уяз», Та1апга, 29 (1982) 1109. 12. С. М. 0'17оппе11 апд 8. С. Бпйш, «Р!погезсепсе 1пппппоаззауз»,Апа1. СЬет 51 !1979) ЗЗА. 13.
Е. Еп8»а11 апд Р. Рег1пьап, «Епяупье-1.1п!сед 1пьппшозогЬепг Аззау !ЕЫБА). ь,!пап!!гас!че Аззау оГ 1ьппшпо8!оЬп1ш б», 1ттипосйетаоу, 8 11971) 871. Глава 25 ВЕК ГЕНО — ГЕНОМИКА И ПРОТЕОМИКА: СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК И АНАЛИЗ БЕЛКОВ Век генов начался, когда Джеймс Уотсон и Фрэнсис Крик раскрыли тайну строения генов: ДНК представляет собой двойную спираль. За это открьпие в 1962 г. они были удостоены Нобелевской премии. Для определения полной последовательности человеческих генов (генома) понадобилось еще 40 лет, и в этом процессе важнейшую роль сыграли аналитические методы и приборы. В настоящей главе мы остановимся на принципах определения последовательности ДНК (секвенировании) и использования секвенирования для определения последовательности генома.
Кроме того, мы рассмотрим методы, позволяющие определять функции белков. Но сначала немного биологии. 25Л. Из чего мы состоим? Белки являются основными строительными блоками нашего организма. Практически вся биологическая активность осуществляется при их участии. Наши мышцы, зубы, печень, кожа, кровь, т. е.
практически все тело, существуют лишь постольку, поскольку существуют белки. Откуда берутся белки? Синтез белков определяется нашими генами (ДНК); «экспрессия гено⻠— это по существу тот процесс, с помощью которого гены контролируют биологические функции организма. Гены кодируют аминокислоты, из которых строятся белки. Все функции клетки закодированы в клеточной ДНК; ДНК определяет, какая клетка будет клеткой волоса, какого цвета будет этот волос, а также многое другое. Гены входят в состав хромосом. Ядра почти всех 100 триллионов клеток, образующих наш организм, содержат 23 пары хромосом, т, е, 46 отдельных хромосом (рис. 25.1). Исключение составляют сперматозоиды и яйцеклетки, содержащие всего по 23 хромосомы.
Каждый родитель передает своему ребенку 23 хромосомы. Ребенок берет лишь часть ДНК от обоих родителей, причем случайным образом, так что каждый малыш обладает только ему свойственным набором родительских генов; исключением являются однояйцовые близнецы, гены которых идентичны. Перед изучением данной главы мы рекомендуем обратиться к сайту зенок огп1 кот! Ьагп1в/ рго>ессдпус Ыпй н прочесп статью «ггот где Селоте го Йе ргозеоме». 25.2. ЧТО ХАКОЕ ДНК2 Рис.
25.2 С.'грукгура хромосомы. Каждая хромосома оорааована скрученной спиралью ДНК; если ее ГЛАВА 25. ВЕК ГЕНО — ГЕНОМИКА И ПРОТЕОМИК)с СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК И АНАЛИЗ БЕЛКОВ 322 нн, ~ Л Н Н Н Аденин (А) ОН ( НΠ— Р= О ( основание 5'-конец О Н НΠ— Р=О ( Цитозин (С) основание О ~ Л и Н НН н О Н НΠ— Р= О Гуанин (О) основание ОН Н 3'-конец Тимин (Т) Рис. 25.4 Рис. 25.5 Олигонуклеотид (при физиологических значениях рН находится в виде аниона) Азотистые основания в составе ДНК.
Между двумя нитями ДНК образуются водородные связи. А образует пару с Т, а Π— с С внимание, что ОН-группа остатка сахара, находяшаяся в положении 3', связана с фосфатной группой в положении 5'. В результате на одном конце фрагмента ДНК всегда расположена 3'-группа, а на другом — 5'-группа.
Если такой однонитевой фрагмент ДНК образует пару с идентичным (точнее комплемеитарным) однонитевым фрагментом, то они укладываются в противоположных направлениях; такую структуру называют антипараллельной. Другими словами, в одной нити остаток сахара расположен нормально, а в другой — «вверх тормашками», 25.3. ПРОЕКТ «ГЕНОМ ЧЕЛОВЕКА» Рис. 25.6 Двойная спираль ДНК, образованная еахарофосфаз иым остовом и удерживаемая водородными связями в пария А Т и 6-С. Воспроизведено З2З Сахаре .--'Т фосфатиын остов 324 ГЛАВА 25. ВЕК ГЕНО — ГЕНОМИКА И ПРОТЕОМИКА: СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК И АНАЛИЗ БЕЛКОВ Германии, Японии и Китая; основную часть финансирования Проекта осуществляли США. Национальный институт здоровья США (Н1Н) и британский фонд «Велком Траст» (%е!!соше Тпзз! оГ Бопбоп) предоставили для реализации Проекта $2,5 млрд долларов.
В США научная сторона Проекта осуществлялась под руководством Национального института по исследованию генома человека и Департамента энергетики США в рамках программы «Геном человека». Первоначально в рамках Проекта ставилась задача закончить сборку генома к 2003 г. Лаборатории-участницы Проекта прочитывали по одному биту за раз, проводя методичное секвенирование каждого клона (см. ниже). В 1998 г. коммерческая группа «Селера Геномикс», основанная бывшим сотрудником Х1Н доктором Крейгом Вентером, выдвинула альтернативный проект и заявила, что закончит определение генома на три года раньше.
Группа «Селера Геномикс» и 13 других академических, некоммерческих и промышленных групп начали секвенирование в сентябре 1999 г., а закончики основную работу уже в октябре 2000 г.! Как им это удалось? Они действовали двумя путями. Во-первых, альтернативная группа использовала данные, полученные к тому времени в рамках основного проекта (эти данные полностью открыты для широкого доступа). Во-вторых, они применили абсолютно новый способ секвенирования, так называемое дробление генома (см. ниже). Кроме того, Селера использовала новое более мощное аналитическое оборудование, основанное не на гель-электрофорезе, а на капиллярном зонном электрофорезе (модель АВ1 3700; подробности см. ниже), разработанное компанией Аррйег1 В!озузгешз, Большая часть участников основного проекта переключилась на ту же технологию, а в июне 2000 г. обе стороны объявили, что практически закончили секвенироваиие.
В феврале 2001 г. каждая сторона опубликовала предварительные результаты своих исследований: основная группа — в №шге, 409 (2001) 860, а Селера — в 5ссепсе, 291 (2001) 1304. Эти публикации можно найти на сайтах ви'чг, папке.сош !ВепоппсзЛпппап и юи л~.зс!епсешайак1пе.ог8/сопгепб/ко1129Пззие5501.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
