Синтез и исследование новых амфифильных соединений на основе производных 3, 7-диазабициклононана (1105713), страница 9
Текст из файла (страница 9)
По осиординат – относительная интенсивность флуоресценции.Исходная суспензия содержала флуорофор, концентрация которого внутрилипосом превышает концентрацию самотушения. Появление дефектов в мембранеи вытекание флуорофора во внешний раствор сопровождалось заметнымувеличением интенсивности его флуоресценции.
Увеличение концентрации CuSO4приводило к повышению скорости вытекания КФ. Вытекание красителя излипосом приводило к резкому возрастанию интенсивности флуоресценциисуспензии. Результат сравнивали с интенсивностью флуоресценции суспензиипосле разрушения липосом детергентом, Тритоном Х-100 34, которую принимализа 100%.333469На рисунке 11 показано, как флуоресценция суспензии модифицированныхлипосом, содержащих во внутреннем объеме КФ, изменилась, когда был добавленраствор CuSO4. В контрольном эксперименте при отсутствии во внешнем растворекатионов меди никакого увеличения флуоресценции суспензии липосом не былообнаружено (кривая 1), что указывает на отсутствие спонтанного высвобождениякрасителя.
Добавление 0,15 × 10-4 М CuSO4 к суспензии липосом привело кзначительному увеличению интенсивности флуоресценции (кривая 2); увеличениеконцентрации соли CuSO4 сопровождалось резким увеличением флуоресценции(кривая 3). Полученные результаты свидетельствуют, что добавление раствораCuSO4 индуцировало высвобождение КФ, большая часть которого просочилась излипосом в течение 1,5 часов после добавления раствора CuSO4. Сравнивая графикина рисунках 11 и 12 можно утверждать, что длина алкильного радикаланезначительно влияет на вытекание КФ из липосом, модифицированных 3,7диалкилпроизводными1,5-диметил-3,7-диазабицикло[3.3.1]нонан-9-оноввприсутствии катионов меди (II).Влияние CuSO4 на вытекание КФ логично связать с формированиемкомплекса Cu2+ с 3,7-диалкил-3,7-диазабицикло[3.3.1]нонан-9-оном и изменениемконформации последнего, что, в свою очередь, оказывает влияние на упаковкулипидов в бислое и резко повышает проницаемость липосомальной мембраны:Схема 2.
Схема вытекания КФ из внутреннего объема липосом приизменении конформации соединений 13-17 за счет комплексообразования с ионамимеди.70Возможность осуществления направленной доставки лекарств к опухолевымклеткамспомощьюмодифицированныхлипосомнапрямуюзависитотспособности бислоя изменять проницаемость при изменении кислотностиокружающего водного раствора.
К достоинствам 3,7-диазабицикло[3.3.1]нонанов вкачестве молекулярных переключателей можно отнести возможность построенияцелойшкалырН-индуцированныхконформационныхпереходовзасчетразнообразия вводимых в каркас заместителей.Нами были проведены эксперименты по измерению проницаемостилипидного бислоя методом кондуктометрии [131] при изменении конформации 3,7диалкил-1,5-диметил-3,7-диазабицикло[3.3.1]нонан-9-онов за счет протонирования.Для этого во внутренний объем липосом мы включили хлорид натрия. Целостностьлипосом со встроенными 3,7-диалкил-1,5-диметил-3,7-диазабицикло[3.3.1]нонан-9онами контролировали, измеряя электропроводность полученной суспензии.
Привытекании соли из внутреннего объема липосом во внешний наблюдаетсяувеличение электропроводности.Рисунок13.Зависимостьотносительнойэлектропроводностилипосом,заполненных NaCl, от времени; липосомы модифицированы 3,7-дидодецил-1,5диметил-3,7-диазабицикло[3.3.1]нонан-9-оном 14.Однако, как видно из рисунка 13 вытекание соли (увеличение относительнойэлектропроводности) наблюдается в интервале рН 8-5, в большей мере при рН 5.При этом доля вытекшей соли сравнительно невелика (не более 8% за 1 час).71Далее нами были проведены эксперименты по комплексообразованию 3,7диалкил-1,5-диметил-3,7-диазабицикло[3.3.1]нонан-9-она с катионами меди (II).Для этого был использован спектральный метод.
Раствор 10-3М CuSO4 смешивали сразличными количествами раствора лиганда 35 (низкомолекулярного аналогаамфифильных 3,7-диазабицикло[3.3.1]нонанов):ONN35На рисунке 14, показано, что оптическая плотность увеличивалась с ростомконцентрации лиганда 35 и достигла предельного уровня при концентрации [35] =2,1×10-3М. Полученная зависимость представлена на рисунке 14 (кривая 1), гдеоптическая плотность выражается в относительных единицах. Изменениеоптической плотности в пределах интервала 0 – 2.1×10-3М в случае с лигандом 35говорит о связывании с ионами Cu2+ , в то время как плато - [35]> 2.1×10-3Мсвидетельствует о насыщении ионов Cu2+ молекулами лиганда 35.
Затем нами былопроведено спектрофотометрическое титрование раствора соли CuSO4 лигандом 14в составе липосомы. Относительная оптическая плотность представлена кривой 2на рисунке 14. Кривую 2 от описанной выше кривой 1 отличает то, что насыщениемеди (10-3М) лигандом 14 происходит при концентрации [14] 1×10-3М, т.е. приэквимолярном соотношении лиганда и соли меди.72оптическая плотность,%120100180604022000123концентрация лиганда*10-3M4Рисунок 14. Спектрофотометрическое титрование.Для получения дополнительных сведений о модифицированных липосомахиспользовали метод дифференциально-сканирующей калориметрии и исследовали,как сдвигается температура плавления в зависимости от того, каким соединениеммодифицированы липосомы.Рисунок 15.
Кривые ДСК для липосом, модифицированных соединениями 6,11, 14, 20.73Контрольным измерением является температура фазового перехода DPPC(дипальмитоилфосфатидилхолин), равная 41ºС. В случае соединений 6 и 14наблюдается уширение пика плавления и небольшое смещение его в область болеенизких температур по сравнению с DPPС, что может свидетельствовать оравномерном распределении данных соединений по липидному бислою. В случае ссоединениями 11 и 20 четких выводов сделать нельзя.3.4. ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОНИЦАЕМОСТИ ЛИПОСОМ, МОДИФИЦИРОВАННЫХ 3,7-ДИАЛКИЛ-1,5-ДИНИТРО-3,7-ДИАЗАБИЦИКЛО[3.3.1]НОНАНАМИИзвестно, что рН многих опухолевых клеток находится в слабокислойобласти (pH может достигать значения 5.6).
Так как достичь быстрого увеличенияпроницаемости липосом при рН 5-7 при использовании 3,7-диалкил-1,5-диметил3,7-диазабицикло[3.3.1]нонан-9-онов не удалось, перед нами встала задачасинтезировать новые конформационные переключатели.Основой для них были выбраны 1,5-динитро-3,7-диазабицикло[3.3.1]нонаны.По литературным данным 3,7-диалкил-1,5-динитро-3,7-диазабицикло[3.3.1]нонанысуществуют в конформации КВ [40] и для них по аналогии с 3,7-диалкил-1,5диметил-3,7-диазабицикло[3.3.1]нонан-9-онами возможен переход КВ-КК как припротонировании в кислых средах, так и при комплексообразовании с катионамидвухвалентных металлов [83-84].Кроме того, введение акцепторных заместителей (нитрогрупп) в положения1,5 должно способствовать смещению увеличения проницаемости липосом при74протонировании в более кислую область по сравнению с 3,7-диалкил-3,7диазабицикло[3.3.1]нонан-9-онами за счет понижения основности атомов азота.В предыдущих разделах нами было высказано предположение о том, чтопричиной образования пор в липосомах при протонировании является изменениеконформации биспидинового скелета, приводящее к движению алкильныхзаместителей внутри бислоя.Также нами исследовался вопрос о количестве метиленовых групп валкильныхзаместителяхприатомахазотав1,5-диметил-3,7-диазабицикло[3.3.1]нонан-9-онах, позволяющих этим соединениям эффективновстраиваться в липидный бислой.
Установлено, что для эффективного встраиваниянеобходимо не менее 10 метиленовых групп.Поэтому нами был осуществлен синтез ряда 1,5-динитро-3,7-диалкил-3,7диазабицикло[3.3.1]нонанов с 12, 13, 16 атомами углерода в алкильном радикале.Для исследования проницаемости липосом в зависимости от рН средыиспользовали метод кондуктометрии. Для этого во внутренний объем липосом мывключали раствор хлорида натрия NaCl и затем измеряли электропроводностьполученнойсистемыприразличныхрН.Наблюдаемоеувеличениеэлектропроводности происходило в результате вытекания соли из внутреннегообъема липосом, что, в свою очередь, свидетельствовало об образовании пор влипидном бислое (схема 3).H+NaClNaClСхема 3. Схема вытекания NaCl при уменьшении рН среды75Максимум возможной для каждого рН электропроводности определяли позначению, получаемому при разрушении липосом детергентом TRITON X-100 34.Для исследования возможного влияния длины алкильного радикала наскорость разрушения липосом провели измерения электропроводности в первые 10минут после добавления аликвоты липосом, модифицированных соединениями 22и 23, в буферный раствор (рисунок 16а, б).относительнаяэлектропроводность0,20,16pH50,12pH7pH 80,08pH90,04время, минуты0024681012Рисунок 16а.
Зависимость относительной электропроводностилипосом, заполненных NaCl, от времени для липосом, модифицированных3,7-дитридецил-1,5-динитро-3,7-диазабицикло[3.3.1]нонаном 23.76Рисунок 16б. Зависимость относительной электропроводностилипосом, заполненных NaCl, от времени для липосом, модифицированных 3,7дигексадецил-1,5-динитро-3,7-диазабицикло[3.3.1]нонаном 22.Сравнивая графики на рисунках 16а, б можно утверждать, что длинаалкильного радикала незначительно влияет на вытекание КФ из липосом,модифицированных3,7-диалкилпроизводными1,5-динитро-3,7-диазабицикло[3.3.1]нонанами, при протонировании.Таким образом, для соединения 23 мы получили следующую зависимость,представленную на рисунке 17. Вытекание NaCl, а значит и нарушениецелостности липосомальной мембраны увеличивается с понижением рН среды идостигает максимальных значений при рН 5.Рисунок 17.
Зависимость относительной электропроводности от рН длясоединения 23.77Следует отметить, что характерным для всех встраиваемых соединенийявляется отсутствие вытекания хлорида натрия при рН 10, а также значительноеувеличение электропроводности, а значит и существенное количество вытекшегохлорида натрия из внутреннего объема липосом в интервале рН 5-7.Причиной образования пор в липосомах при протонировании, по-видимому,является движение алкильных заместителей внутри бислоя при измененииконформации биспидинового скелета.Схема 4. Схема увеличения проницаемости липидного бислоя приуменьшении рН среды.Для получения дополнительных сведений о модифицированных 1,5динитро-3,7-диазабицикло[3.3.1]нонанами липосомах провели их титрованиераствором поли-(4-стиролсульфонатом) натрия (ПСС натрия) 36:36Титровали суспензию липосом в буферном растворе с рН 5.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
