Синтез и исследование новых амфифильных соединений на основе производных 3, 7-диазабициклононана (1105713), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Вкачестве перспективных соединений для модификации липосом нами предложеныпроизводные3,7-диазабицикло[3.3.1]нонановзаместителями при атомах азота.сдлиннымиалкильными613.2.1. Определение размера и электрофоретической подвижности липосом,модифицированных производными 3,7-диазабицикло[3.3.1]нонанаСцельюисследованиястабильностилипосом,содержащихN,N‘-замещенные 3,7-диазабицикло[3.3.1]нонан-9-оны, нами проведена серия экспериментов по их встраиванию в липидный бислой.Модифицированные липосомы были получены методом озвучивания [129130] из смеси фосфатидилхолина (ФХ) 32 и синтезированных производных 3,7диацил-1,5-диметил-3,7-диазабицикло[3.3.1]нонан-9-онов 5-9 в соотношении 3:1(мольная доля синтезированного амфифильного соединения составляла 0,25):32Нами было установлено, что при встраивании в липидный бислой 3,7диацил-1,5-диметил-3,7-диазабицикло[3.3.1]нонан-9-она с заместителями, содержащими7атомовуглерода,аименно3,7-дигептаноил-1,5-диметил-3,7-диазабицикло[3.3.1]нонан-9-она 5, получаются липосомы с дефектами.
Такиемодифицированные липосомы не могут использоваться в качестве молекулярныхконтейнеров, так как инкапсулируемое вещество вытекает из липосом в процессеих приготовления. Это можно объяснить слишком «коротким» углеводороднымрадикалом, содержащим лишь 7 атомов углерода. Поэтому в дальнейшем намибыли синтезированы для встраивания в липидный бислой производные с болеедлинными заместителями с числом углеродных атомов в радикале от 11 до 16.Размермодифицированныхлипосом(гидродинамическийдиаметр)определялся методом динамического рассеяния света.
Данный метод позволяетопределить коэффициент диффузии дисперсных частиц в жидкости путем анализакорреляционной функции флуктуаций интенсивности рассеянного света. Далее, изкоэффициентадиффузиирассчитываетсярадиуснаночастиц.Определениепроводили при нескольких значениях рН. Размер варьировался в пределах 50-75нм.62Подобные измерения проводили также через 24 часа, при этом диаметрлипосомзначительнонеменялся.Такимобразом,размерлипосом,модифицированных соединениями 6-8, существенно не изменяется в зависимостиот времени и рН внешнего раствора в интервале от 10 до 5. Для определенияэлектрофоретическойподвижностичастициспользовалиметодлазерногомикроэлектрофореза.
Измерения проводили при нескольких рН. Изменение pHвнешнего раствора с 10 до 5 («закисление раствора») приводило к появлению наповерхности липосом положительного заряда. Для сравнения были полученылипосомы только из фосфатидилхолина 32, размер таких липосом варьировался винтервале 40-50 нм.С использованием электронного микроскопа можно представить, каквыглядят липосомы, построенные их фосфатидилхолина (ФХ).Рисунок 8. Фотография липосом под электронным микроскопом.Отметим, что модифицированные липосомы существенно не отличаются отлипосомнаосновефосфатидилхолина(ФХ)поразмеру.Аналогичныеэксперименты по исследованию размера и электрофоретической подвижностибылиосуществленыдля1,5-диметил-3,7-ди-(ω-диэтиламиноундеканоил)-3,7-диазабицикло[3.3.1]нонан-9-она 11 (рис.
9).ЭФП, (мкм/с)/(В/см)631,210,80,60,40,20-0,2 49рН14Рисунок 9. Зависимость электрофоретической подвижности липосом, модифицированных соединением 11, от рН среды.Размермодифицированныхсоединением11липосомоставалсявсоответствующем интервале (60-80 нм), однако значения электрофоретическойподвижности отличаются от уже приведенных значений ЭФП для липосом,построенных из ФХ и липосом, модифицированных 3,7-диацил-1,5-диметил-3,7диазабицикло[3.3.1]нонан-9-онами. Соединение 11 отличается от соединений 6-8наличием на конце ацильного заместителя третичной аминогруппы.
Судя пографику на рисунке 9, внешняя поверхность липосом, модифицированныхсоединением 11, имеет положительный заряд при всех значениях рН висследованном нами интервале.Далее были получены модифицированные липосомы методом озвучиванияиз смеси фосфатидилхолина 32 и синтезированных производных 3,7-диалкил-1,5диметил-3,7-диазабицикло[3.3.1]нонан-9-онов 13-17 в соотношении 3:1.13Размерчастиц,15построенныхих17фосфатидилхолинаиалкильныхпроизводных 1,5-диметил-3,7-диазабицикло[3.3.1]нонан-9-она 13-17 находится винтервале 40-80 нм.
Значительных изменений в размере модифицированныхлипосом в интервале рН 10-5 и через 24 часа не наблюдается. Измерения ЭФПпроводили для нескольких рН. Данные представлены на рисунке 10.ЭФП, (мкм/с)/(В/см)6432,521,510,50-0,5 4123681012рНРисунок 10. Зависимость электрофоретической подвижности липосом,модифицированных соединениями 13 (кривая 1), 15 (кривая 2) и 17 (кривая 3).Липосомы, построенные только из фосфатидилхолина, обладают значениямиэлектрофоретическойподвижности,колеблющимисяоколо0,таккакфосфатидилхолин 32 практически электронейтрален, однако в присутствиинекоторых примесей в коммерческом фосфатидилхолине ЭФП будет отличаться от0, но несущественно. Из рисунка 10для липосом, модифицированныхсоединениями 13, 15 и 17 видно изменение значений ЭФП при изменении рНвнешнего раствора, а значит и изменение свойств липидного бислоя.Для 3,7-гексадецил-1,5-диметил-3,7-диазабицикло[3.3.1]нонан-9-она 17 смаксимальной длиной радикала были получены такие же результаты, как и для 1,5диметил-3,7-ундецил-3,7-диазабицикло[3.3.1]нонан-9-она 13.Таким образом, в исследованных пределах длина алкильного радикала неоказываетсущественноговлияниянаразмеризаряднаповерхностимодифицированных липосом.Были получены липосомы, модифицированные синтезированными 3,7диалкил-1,5-динитро-3,7-диазабицикло[3.3.1]нонанами 21-23, вышеприведеннымобразом.Размер частиц со встроенными соединениями 21-23 находился в интервале60-80 нм.
Значительных изменений в размере модифицированных липосом приизменении рН не наблюдается. Измерения ЭФП проводили для нескольких рН.Данные представлены в таблице 5:65Таблица 5. Значения электрофоретической подвижности для липосом,модифицированных соединениями 21-23.ЭФП, (мкм/с)/(В/см)pHR= C12H25R=С13H27через 48 часовR=C16H33через 36 часоврН 10-0,32-0,64-0,36-2,4-0,31рН 8-0,85-1,34-0,52-2,25-0,54рН 7-1,43-0,03-0,28-0,69-0,58рН 50,010,540,710,111,43Примечание – В таблице обозначение «R» соответствует алкильным заместителям приатомах азота в положениях 3,7 для 1,5-динитро-3,7-диалкил-3,7-диазабицикло[3.3.1]нонановИз данных, представленных в таблице 5, видно, что электрофоретическаяподвижность частиц (а значит, и их заряд) меняются с течением времени.Небольшой отрицательный заряд, наблюдаемый при рН 10 связан с присутствиемпримеси в фосфадитилхолине.
При рН 5 во всех случаях наблюдается небольшойположительный заряд, свидетельствующий о протонировании третичных атомовазота в 3,7-диалкил-1,5-динитро-3,7-диазабицикло[3.3.1]нонанах. Появляющийсясо временем на поверхности липосом дополнительный отрицательный зарядсвязан, по-видимому, с окислением фосфатидилхолина.Модифицированные липосомы были получены методом озвучивания изсмесифосфатидилхолинадиазабицикло[3.3.1]нонан-9-олаи3231в1,5-диметил-3,7-дипентадецил-3,7соотношении3:1синтезированного амфифильного соединения составляла 0,25).(мольнаядоля66Нами были получены следующие результаты, представленные в таблице 6.Таблица 6. Значения гидродинамического диаметра и электрофоретическойподвижности для липосом, модифицированных соединением 31.рНd, нмЭФП, (мкм/с)/(В/см)10701,059740,788681,037651,205662,44Модифицированные липосомы значительно положительно заряжены за счетатомов азота амфифильных заместителей.3.3.
ИССЛЕДОВАНИЕ ПРОНИЦАЕМОСТИ ЛИПОСОМ, МОДИФИЦИРОВАННЫХ 3,7-ДИАЛКИЛ-1,5-ДИМЕТИЛ-3,7-ДИАЗАБИЦИКЛО[3.3.1]НОНАН-9ОНАМИНами была проведена серия экспериментов по управляемому изменениюпроницаемостилипосомальноймембраны,содержащейвстроенныевнеепроизводные 1,5-диметил-3,7-диазабицикло[3.3.1]нонана с длинными алкильнымизаместителями.В частности,представляет интерессоздание стимул-чувствительныхлипосомальных контейнеров, реагирующих на содержание катионов меди, чтоможет быть использовано при терапии ряда патологий, в том числе болезниВильсона.Дляисследованияизмененияпроницаемостилипосомприкомплексообразовании с катионами меди (II) использовали следующую схему. Вовнутреннийобъемкарбоксифлуоресцеинлипосом(КФ).мывключилиИсходнаяфлуоресцентнуюсуспензиясодержаламетку–флуорофор,концентрация которого внутри липосом превышает концентрацию самотушения.67Появление дефектов в мембране и вытекание флуорофора во внешний растворсопровождалось заметным увеличением интенсивности его флуоресценции.Целостностьлипосомсодиазабицикло[3.3.1]нонан-9-онамивстроенными3,7-диалкил-1,5-диметил-3,7-контролировали,измеряяинтенсивностьфлуоресценции полученной суспензии.
Для этого использовали суспензии,предварительно разбавленные боратным буферным раствором (рН 9) доконцентрации 1мг/мл.Добавление водного раствора CuSO4 к 1 мг/мл суспензиям липосомсопровождалось заметным увеличением флуоресценции, что указывало навытекание КФ из внутреннего объема липосом в окружающий раствор.Рисунок 11. Влияние 3,7-дидодецил-1,5-диметил-3,7-диазабицикло[3.3.1]нонан-9-она 14 на липидный бислой в присутствии ионов меди (14/ФХ липосомы(кривая 1), 14/ФХ липосомы + 0,15×10-4M CuSO4 (кривая 2), 14/ФХ липосомы +1,4×10-4M CuSO4 (кривая 3) и ФХ липосомы + 1,4×10-4M CuSO4 (кривая 4),[14]=3,3× 10–4 M (кривые 1-3); 10-2 M боратный буфер, pH 9).
По оси ординат –относительная интенсивность флуоресценции.68Рисунок 12. Влияние 3,7-дигексадецил-1,5-диметил-3,7-диазабицикло[3.3.1]нонан9-она 17 на липидный бислой при комплексообразовании с ионами меди (17/ФХлипосомы (кривая 1), 17/ФХ липосомы + 0,45×10-4M CuSO4 (кривая 2), 17/ФХлипосомы + 1,4×10-4M CuSO4 (кривая 3) и ФХ липосомы + 1,4×10-4M CuSO4(кривая 4), [17]=3,3× 10–4 M (кривые 1-3); 10-2 M боратный буфер, pH 9).
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
