Определение флавоноидов горянки и их метаболитов методом тандемной хроматомасс-спектрометрии высокого разрешения (1105645), страница 12
Текст из файла (страница 12)
Этот метод является эффективным дляфрагментации большинства «малых» молекул, в том числе флавоноидовгорянки. Проводя исследования при энергии соударений в диапазоне 10-50 Вc шагом 10 В, выбрали энергию 20 B, при которой наблюдается появлениепервыхион-продуктов.Происходитотщеплениеуглеводныхзаместителей (табл. 15): рамнозного – у икариина (с образованием иона сm/z 531,1861) и икаризида II (m/z 369,1333), глюкозного – у икаризида I(m/z 369,1333) и эпимедина А (m/z 677,2440), ксилозного – у эпимедина В(m/z 677,2440).Придальнейшейфрагментациинаблюдаетсяпоследовательное отщепление углеводных заместителей, при этом сначалапроисходит потеря углеводных групп в положении С3, затем в положении С7собразованиемион-продуктасm/z 369,1333,аперегруппировкаизопентеновой группы в положении С8 приводит к появлению ион-продуктасm/z 313,0707.Такимобразом,m/z 369,1333и313,0707являютсяхарактеристичными массами при обнаружении неизвестных флавоноидовгорянки и их отнесении к данному классу соединений, так как соответствуютфрагментам, общим для действующих соединений растений рода Epimedium.На основании предполагаемых структур характеристичных фрагментныхионов, представленных нами ранее с помощью программ HighChem MassFrontier и HyperChem (табл.
А1), на рис. 18 изображена предположительнаясхема фрагментации флавоноидов горянки.Таблица 15 – Характеристичные фрагментные ионы флавоноидов горянки в МСn-спектрах, полученных в условиях диссоциации,индуцируемой соударениемСоединениеMC677,2440 (100)Икаритин369,1333 (100),313,0707 (5)531,1861 (100)Икаризид IИкаризид II515,1912 (100),369,1333 (40)839,2968 (100)Эпимедин А809,2863 (100)Эпимедин В[809,2863]:677,2440 (100),531,1861 (50),809,2863 (40)MC3[677,2440→531,1861]:369,1333 (100),313,0707 (10)MC4-------[839,2968→677,2440]:531,1861 (100),677,2440 (30),369,1333 (10),839,2968 (3)[809,2863→677,2440]:531,1861 (100),677,2440 (30),369,1333 (10),809,2863 (5)[839,2968→677,2440→531,1861]:369,1333 (100)313,0707 (10)[809,2863→677,2440→531,1861]:369,1333 (100)313,0707 (10)80[ион-предшественник]: m/z (Iотн, %)ИкариинMC2[677,2440]:531,1861 (100),677,2440 (30),369,1333 (10)[369,1333]:313,0707 (100),369,1333 (55)[531,1861]:369,1333 (100)313,0707 (10)[515,1912]:369,1333 (100)313,0707 (10)[839,2968]:677,2440 (100),531,1861 (70),839,2968 (20)811415H3C 13 CH312R1O711819 O510 4+OH2H3CO3 OCH34'1'263'2'5'6'R2R3OCH3H3CCH3OOCH3R1OCH3ORO+OH2R1OO2OH+OH2OH3COCH3OCH3HOOOH+OH2Om/z 369,1333OCH2OCH3OOH+OH2Om/z 313,0707Рис.
18. Предположительная схема фрагментации флавоноидов горянки, где дляикариина: R1 - глюкозил, R2 - рамнозил, R3 - водород; для икаритина: R1, R2, R3 водород; для икаризида I: R1 - глюкозил, R2, R3 - водород; для икаризида II: R1, R3водород, R2 - рамнозил; для эпимедина А: R1, R3 - глюкозил, R2 - рамнозил; дляэпимедина B: R1 - глюкозил, R2 - рамнозил, R3 – ксилозил.82Третий шаг заключался в создании библиотеки МСn-спектровисследованных соединений, которая необходима для поиска подобныхспектров при обнаружении неизвестных действующих компонентов растенийрода Epimedium.Последнимфлавоноидовэтапом,горянки,спектрометрическогопозволяющимявлялосьдетектированияупроститьсозданиесобнаружениеалгоритмаиспользованиеммасс-зависимогосканирования при регистрации нейтральных потерь (132,0423, 146,0579 и162,0528 Да, указывающих на отщепление ксилозного, рамнозного иглюкозного остатков соответственно).
В данном методе каждое последующееМС сканирование запускается только для ионов-продуктов, полученных припредыдущемМСсканированииспредварительноустановленнымивеличинами нейтральных потерь.Эффективность разработанного метода подтвердили установлениемструктуры неизвестного компонента в экстракте горянки коротконожковой(Epimedium brevicornum), который готовили согласно разд. 2.7.2. Времявыхода аналита составляло 4,2 мин. (рис. 19А). В МС4-спектре данногосоединения присутствовали ионы с m/z 369,1333 и 313,0707, указывающие напринадлежность к флавоноидам горянки (рис.
19Б). Фрагментный ион сm/z 531,1861 в MC3-спектре отличается от иона с m/z 369,1333 в MC4-спектрена 162,0528 Да, что соответствует отщеплению глюкозного остатка,вероятно, в положении С7, так как именно при этом углеродном атоме связьс углеводной группой более стабильна, чем при С3. Ион-продукт сm/z 677,2440 в МС2-спектре отличается от иона с m/z 531,1861 в MC3-спектрена массу рамнозного остатка (146,0579 Да), а MC2-спектр неизвестногосоединения подобен МС-спектру икариина, что указывает на рамнозныйзаместитель в структуре исследуемого компонента в положении С3.
Массспектр первого порядка содержит интенсивный ион с m/z 823,3019, который,вероятно, соответствует протонированной молекуле [M+H]+, а нейтральная83потеря 146,0579 Да в MC2-спектре показывает наличие двух рамнозныхгрупп в положении С3.Рис. 19. Хроматограмма по полному ионному току этанольного экстракта горянкикоротконожковой (Epimedium brevicornum) (А) и MCn-спектры соединения современем выхода 4,2 мин (Б).Таким образом, предполагаемая структура неизвестного соединениясогласнолитературнымэпимедину С (рис. 20).данным[96,204],соответствует84Рис. 20. Структурная формула эпимедина С (брутто-формула C39H50O19,M=822,2946), где glu- глюкозил, rha – рамнозил.С целью дополнительного подтверждения, что исследуемый компонентявляется эпимедином С, преобрели СО данного соединения и изучили егохроматографическиепараметры(табл.
16,рис. 21)ифрагментацию(табл. 17).Таблица 16 – Параметры хроматографического разделения СО эпимедина С на колонкеHypersil Gold aQ (150 × 2,1 мм, размер зерна сорбента 3 мкм) при скорости потока0,6 мл/мин (при расчётах использовали величину мёртвого времени, равного 0,7 мин)ВеществоВремя удерживания, минРазрешение пиковЭпимедин С4,191,7Коэффициентселективности1,1Таблица 17 – Характеристичные фрагментные ионы эпимедина С в МСn-спектрах,полученных в условиях диссоциации, индуцируемой соударением[ион-предшественник]:m/z (Iотн, %)СоединениеЭпимедин СMCMC2[823,3019]:823,3019 677,2440 (100),(100)531,1861 (50),823,3019 (35)MC3MC4[823,3019→677,2440]:[809,2863→677,2440→531,1861 (100),531,1861]:677,2440 (30),369,1333 (100)369,1333 (12),313,0707 (12)823,3019 (6)85Рис.
21. Хроматограммы в режиме сканирования по выбранным ионным переходамраствора, содержащего 0,1 мкг/мл икариина, икаритина, эпимединов A, B, С иикаризидов I, II.Полученные результаты подтверждают предположение о том, чтонеизвестное соединение – эпимедин С в экстракте горянки коротконожковой(Epimedium brevicornum).Такимобразом,сиспользованиемметодатандемноймасс-спектрометрии при ионизации электрораспылением изучена фрагментацияположительно заряженных ионов основных флавоноидов горянки –икариина,икаритина,характеристичныеикаризидов I, II,фрагментныеионы,эпимединов А, B,позволяющиеопределеныподтверждатьпринадлежность неизвестных соединений к действующим компонентамрастений рода Epimedium.863.3 Разработка способа экстракции флавоноидов из горянкиОчевидно, что качество фармакологических препаратов, создаваемыхна основе растительного сырья, зависит от технологий извлечения БАВ излекарственных растений. Экстракция является важным этапом любогоисследования лекарственных растений, и играет решающую роль вполучении конечных результатов.
В разд. 1.2 приведена информация поспособам экстракции флавоноидов горянки. Однако, в большинстве своём,все они сводятся к выделению основных компонентов традиционнымиорганическими растворителями в различных условиях и имеют ряднедостатков, основным из которых является необходимость удалениярастворителя из экстракта. В настоящее время технология экстрагированиялекарственного растительного сырья сверхкритическими газами являетсяперспективным методом получения экстрактов БАВ.
Данный способпозволяет рационально использовать растительное сырье и энергоресурсы, аэкстракты, полученные с применением этих методов, дают возможностьрасширить номенклатуру новых фитопрепаратов [177]. В связи с этимстановится актуальной задача исследования возможности применения СКСО2 для выделения флавоноидов из горянки, а также сравнительная оценкаколичественногосодержанияактивныхкомпонентоввэкстрактах,полученных извлечением сверхкритическим диоксидом углерода и методомжидкостной экстракции. Эксперимент осуществляли согласно разд. 2.7.3.Основными параметрами, влияющими на эффективность экстракции,являются её продолжительность, давление и температура. Влияние данныхпараметров на общее количество извлекаемых флавоноидов показано нарис.
22-24.87Рис. 22. 3D-график зависимости суммарной массовой доли извлекаемыхфлавоноидов (%) от давления и температуры при времени экстракции 30 мин.Зависимость на рис. 22 показывает, что с увеличением давлениянаблюдается повышение суммарного выхода флавоноидов с достижениемего максимального значения при величине 30 МПа на уровне 2,6% от массыэкстрагируемогосырья.Эффективностьэкстракциидостигаетмаксимального значения при температуре 50 °С. Снижение или повышениетемпературы приводит к уменьшению выхода целевых компонентов.Проанализировав данные рис. 23, делаем вывод, что в качествеоптимального времени экстракции можно принять 30 мин.
Дальнейшееувеличение продолжительности процесса приводит к дополнительнымэкономическимзатратамсверхкритический СО2).(втомчисле,насо-растворительи88Массовая доляизвлекаемых компонентов, %0,90,80,70,6Икариин0,5Икаризид II0,4Эпимедин АЭпимедин В0,3Эпимедин С0,20,1015 минут30 минут45 минутРис. 23. Выход целевых компонентов при различном времени экстракции.Для оценки эффективности метода СK-CO2 было проведено сравнениеего с традиционным методом жидкостной экстракции 50%-ным этанолом поддействием ультразвука.На рис. 24представлена диаграмма, показывающая количествоизвлекаемых биологически активных соединений при использовании данныхметодов экстракции.0,9Массовая доляизвлекаемых компонентов, %0,80,70,6ИкариинИкаризид IIЭпимедин АЭпимедин ВЭпимедин С0,50,40,30,20,10Жидкостная экстракцияСверхкритическая экстракцияРис.
24. Выход извлекаемых компонентов при использовании различных методовэкстракции.Из представленных данных видно, что суммарное количествоизвлекаемых компонентов методом СK-CO2 в 2,5 раза выше, чем с помощью89жидкостной экстракции этанолом под действием ультразвука. Варьированиепараметров экстракции позволяет регулировать выход целевых веществ.Установлено,чтомаксимальныйвыходдействующихкомпонентовдостигается при температуре 50 °С, давлении 30 МПа и продолжительности30 мин.3.4 Разработка способа определения флавоноидов горянки в мочеВ последние годы для идентификации и определения флавоноидовгорянкивсечащеиспользуютВЭЖХ/МС,гдеподготовкапроббиологических образцов включает в себя осаждение белков и обессоливаниеорганическимрастворителемилижидкостно-жидкостнуюэкстракциюэтилацетатом (разд. 1.5).В данной работе исследовали различные способы экстракции икариина,икаритина, икаризидов I, II, эпимединов А, В из мочи и влияние матрицы настепеньионизацииприопределениидействующихкомпонентов.Эксперимент осуществляли согласно разд.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
