Определение флавоноидов горянки и их метаболитов методом тандемной хроматомасс-спектрометрии высокого разрешения (1105645), страница 13
Текст из файла (страница 13)
2.7.4, а условия, выбранные вразд. 3.1.2, применяли для хроматографического разделения и массспектрометрического детектирования.В качестве модельной биожидкости использовали мочу человека. Дляполучения образца с концентрацией целевых веществ 0,1 мкг/мл в 5 мл мочивносили0,1 млраствораикариина,икаритина,икаризидов I, II,эпимединов А, В с концентрацией 5 мкг/мл, полученного в результатепоследовательного разбавления метиловым спиртом исходного раствора сконцентрацией 0,1 мг/мл, приготовленного согласно разд.
2.6.5. В качествебланковогообразцаиспользоваласьмочабезвнесенияактивныхкомпонентов.Учитывая свойства аналитов, метод анализа и объект исследованийбыло выбрано несколько направлений разработки процедур подготовки проб.1. Анализсупернатантацентрифугирования.послеобессоливанияацетонитриломи902. ЖЖЭ. С целью выбора оптимального метода исследовали три типаэкстракции:щелочную,нейтральнуюикислуюсиспользованиемэкстрагирующих систем с разными индексами полярности и элюирующейсилой [91], таких как хлористый метилен; ацетонитрил; смесь диэтилового итрет-бутилметилового эфиров в соотношении 9:1 (по объёму); смесь гексанас хлористым метиленом в соотношении 85:15 (по объёму); смесьизобутиловый спирт: изопропиловый спирт: этилацетат (40:30:30 по объёму).Поскольку исследуемые вещества метаболизируют в организмевозможнопроведениесобразованиемпроцедурыглюкуроновыхпроизводныхдеглюкуронированияснеобходимоиспользованиемсоответствующих ферментов.При проведении ферментативного гидролиза с бета-глюкуронидазойобнаружено, что ещё до инкубирования флавоноиды горянки гидролизуются,икариин, например, до икаризида II и икаритина (рис.
25), что делаетневозможным использование данного фермента для процесса подготовкипроб биологических образцов с целью обнаружения непосредственноактивных компонентов, однако может быть использован для групповогоопределения флавоноидов горянки.3. ТФЭ. Для подготовки проб были выбраны картриджи SUPELCODSC-18 (с неполярным сорбентом силикагелем С-18) и HLB. Последниепредставляют собой модифицированный полистирол и благодаря развитойгидрофильно-липофильной поверхности сорбента способны удерживатьширокий диапазон соединений с разной полярностью.
Для ТФЭ характерныболееширокиевозможностидляселективногоизвлеченияиконцентрирования извлекаемых аналитов, чем для ЖЖЭ. Также следуетотметить, что при валидации аналитической методики использование ТФЭпрактическиполностьюприводитквыполениютребованийпоповторяемости и правильности. Однако у данной процедуры есть инедостатки, среди которых дороговизна и трудоёмкость.91Рис. 25. Схема гидролиза икариина под действием бета-глюкуронидазы.Контроль полноты экстракции и остальных аналитических этаповподготовки проб (таких как очистка и концентрирование образца) проводилиметодомдобавоквнутреннегостандарта(близкоепоструктуреиэкстракционным свойствам соединение – куместрол (рис.
6)) [138, 143, 206].Идентификацию аналитов в образцах проводили по трём параметрам:время удерживания аналитов и внутреннего стандарта (рис. 26), выбранныехарактеристичныеионныепереходыисоотношенияинтенсивностейфрагментных ионов, которые оставались постоянными в широком диапазонеконцентрацийвнутреннего(табл. 11).стандартаОптимальнаясоставила50 В,энергияастолкновенийионныйпереходдля—сm/z 269,0445 → 241,0491 (100%), 197,0595 (100%), 213,0543 (72%), 225,0543(25%) (рис. 27).Результаты выбора процедур подготовки проб представлены в табл.
18.92Рис. 26. Хроматограммы в режиме сканирования по выбранным ионным переходамраствора, содержащего 0,1 мкг/мл икариина, икаритина, эпимединов A, B,икаризидов I, II и куместрола (внутреннего стандарта).Рис. 27. МС/MC-спектр пика, соответствующего куместролу (внутреннемустандарту) в режиме регистрации положительно заряженных ионов при энергиифрагментации - 50 В.Таблица 18 – Коэффициенты извлечения аналитов при использовании различных процедур подготовки проб (P=0,95, n=10)ТипэкстракцииЖЖЭкислаяикариинаикаритинаикаризида Iикаризида IIХлористый метилен19±223±425±417±218±321±320±3Ацетонитрил53±656±760±652±751±755±456±415±320±421±313±214±319±420±4000000035±538±535±634±433±436±537±5Хлористый метилен2,0±0,44,3±0,31,1±0,10000Ацетонитрил79±684±786±576±675±771±570±59,0±1,78,0±0,95,1±0,49,3±1,07,2±1,38,4±1,27,9±0,9000000073±380±574±475±569±365±564±4Диэтиловый эфир:трет-бутилметиловыйэфир(9: 1 по объёму)Гексан: хлористыйметилен(85: 15 по объёму)Изобутиловый спирт:изопропиловый спирт:этилацетат(40: 30:30 по объёму)Диэтиловый эфир:трет-бутилметиловыйэфир(9: 1 по объёму)Гексан: хлористыйметилен(85: 15 по объёму)Изобутиловый спирт:изопропиловый спирт:этилацетатэпимедина А эпимедина Вэпимедина C93ЖЖЭщелочнаяКоэффициент извлечения, %ЭкстрагирующаясистемаТипэкстракцииЭкстрагирующаясистемаКоэффициент извлечения, %икариинаикаритинаикаризида Iикаризида IIэпимедина А эпимедина Вэпимедина CХлористый метилен6,0±1,910±14,3±0,45,6±0,53,5±0,33,7±0,23,1±0,3Ацетонитрил72±480±573±475±664±462±561±431±336±526±224±235±633±531±3000000049±454±545±441±439±337±436±497±698±595±394±493±593±493±390±494±391±690±688±486±487±399±799±597±798±995±894±895±7(40:30:30 по объёму)94Диэтиловый эфир:трет-бутилметиловыйэфирЖЖЭ(9: 1 по объёму)нейтральнаяГексан: хлористыйметилен(85: 15 по объёму)Изобутиловый спирт:изопропиловый спирт:этилацетат(40:30:30 по объёму)ТФЭSUPELCO HLB 200 мгТФЭDSC-18 200Прямой анализ95Из результатов, представленных в таблице 18, видно, что наибольшегоизвлеченияудалосьдостигнутьприпроведениипрямогоанализасупернатанта и после сорбционного концентрирования с картриджамиSUPELCO DSC-18 и HLB.
Приведенные данные также свидетельствуют отом, что при проведении ЖЖЭ две экстрагирующие системы: ацетонитрил исмесь изобутилового, изопропилового спиртов и этилацетата в щелочныхусловиях показывают наилучшие коэффициенты по извлечению.Для оценки селективности выбранных характеристичных ионныхпереходов изучили влияние мешающих фоновых веществ в биологическойжидкости, проанализировав 20 экстрактов бланковых образцов мочи. Накаждой хроматограмме производили анализ участков, соответствующихвременам удерживания определяемых веществ в пределах одной минуты.Селективность считали приемлемой, если на всех хроматограммах науказанных участках не было интерферирующих пиков с отношениемсигнал/шум более или равным 3:1.На специфичность и чувствительность определения веществ сиспользованием масс-селективного детектора могут влиять компонентыбиологической матрицы, которые могут коэлюироваться совместно саналитами,оказываявлияниенапроцессионизациивмасс-спектрометре [207], подавляя или усиливая её [208, 209].
Этот феномен былвпервые описан в 1993 г. и получил название «матричный эффект» [210].Основной причиной подавления ИЭР является изменение свойствспрея из-за наличия матричных (биогенных) удерживаемых соединений,влияющих на эффективность образования или испарения капель в спрее, темсамым, на количество заряженных ионов в газовой фазе, попадающих затем вмасс-спектрометр [211-213].Матричный фактор вычисляли по формуле (1), представленной вработах [183, 214].96MF гдеS1S1(1)S2 ,– площадь пика для пробы с добавкой аналита в матрицу послееё пробоподготовки;S 2 – площадь пика для стандартного раствора аналита.Матричныйбиологическихэффектобразцов.частосвязанВлияниесматрицынедостаточнойприпрямомочисткойанализесупернатанта значительно больше, чем при ТФЭ с картриджами SUPELCODSC-18 и HLB (табл.
19).Учитывая степень экстракции и матричный эффект, делаем вывод, чтонаиболее приемлемым способом подготовки проб является ТФЭ скартриджами HLB.Для оценки влияния используемых в процессе подготовки образцовбиологических проб реактивов на степень ионизации аналитов провелианализ экстракта воды. При этом существенного матричного эффекта ненаблюдали.Сравнительный анализ 20 образцов мочи показал, что степеньизвлечения аналитов и матричный эффект не изменяются от образца кобразцу.Такимобразом,врезультатепроведённыхэкспериментальныхисследований разработана методика определения флавоноидов горянки вмоче методом ВЭЖХ-MC/MC с использованием ЭРИ в режиме регистрациивыбранных ионных переходов для положительно заряженных ионов.Оценены степень извлечения и влияние матрицы на ионизацию аналитов.Разработанныйспособявляетсяспецифичнымичувствительным,позволяющим сочетать как качественное, так и количественное определениефлавоноидов горянки в биопробах.Таблица 19 – Результаты исследований по выбору процедур пробоподготовки (P=0,95, n=10)ТипэкстракцииЭкстрагирующая системаМатричный факторикарииникаритиникаризид Iикаризид IIэпимедин Аэпимедин Вэпимедин CХлористый метилен0,74±0,090,69±0,080,71±0,080,82±0,090,79±0,110,71±0,090,73±0,12Ацетонитрил0,81±0,080,75±0,110,74±0,110,79±0,100,78±0,110,76±0,090,82±0,08трет-бутилметиловый эфир 0,58±0,080,51±0,070,59±0,090,54±0,080,50±0,080,49±0,050,51±0,110,75±0,090,79±0,110,74±0,120,73±0,110,78±0,140,69±0,080,75±0,080,85±0,120,84±0,110,81±0,120,79±0,090,78±0,120,83±0,070,82±0,080,71±0,050,74±0,090,69±0,080,65±0,010,67±0,120,71±0,080,69±0,12Диэтиловый эфир:ЖЖЭ(9: 1 по объёму)кислаяГексан: хлористый метилен(85: 15 по объёму)97Изобутиловый спирт:изопропиловый спирт:этилацетат(40: 30:30 по объёму)ЖЖЭщелочнаяХлористый метиленТипэкстракцииЭкстрагирующая системаМатричный факторикарииникаритиникаризид Iикаризид IIэпимедин Аэпимедин Вэпимедин C0,73±0,090,69±0,110,70±0,090,74±0,080,71±0,050,79±0,050,75±0,08трет-бутилметиловый эфир 0,49±0,050,51±0,060,53±0,070,54±0,090,56±0,080,58±0,060,54±0,090,81±0,080,79±0,070,80±0,040,79±0,080,75±0,090,76±0,050,82±0,080,86±0,090,84±0,100,81±0,110,80±0,090,82±0,070,81±0,080,82±0,09Хлористый метилен0,69±0,050,65±0,080,66±0,060,61±0,090,64±0,080,61±0,090,68±0,08Ацетонитрил0,84±0,090,81±0,080,89±0,080,83±0,090,82±0,050,81±0,080,79±0,09трет-бутилметиловый эфир 0,44±0,070,43±0,060,45±0,050,45±0,010,46±0,020,48±0,010,51±0,03АцетонитрилДиэтиловый эфир:(9: 1 по объёму)Гексан: хлористый метилен(85: 15 по объёму)Изобутиловый спирт:изопропиловый спирт:этилацетат98(40:30:30 по объёму)ЖЖЭнейтральнаяДиэтиловый эфир:(9: 1 по объёму)ТипэкстракцииЭкстрагирующая системаГексан: хлористый метилен(85: 15 по объёму)Изобутиловый спирт:изопропиловый спирт:этилацетатМатричный факторикарииникаритиникаризид Iикаризид IIэпимедин Аэпимедин Вэпимедин C0,82±0,080,81±0,050,82±0,060,81±0,030,79±0,040,81±0,050,83±0,030,74±0,080,79±0,060,75±0,070,73±0,080,69±0,080,64±0,090,79±0,060,94±0,090,95±0,090,97±0,050,98±0,060,97±0,050,94±0,060,96±0,080,91±0,010,92±0,050,89±0,060,88±0,050,94±0,070,95±0,040,93±0,091,32±0,111,34±0,091,24±0,091,10±0,081,10±0,091,12±0,081,01±0,07(40:30:30 по объёму)ТФЭSUPELCO HLB 200 мгТФЭПрямой анализ99DSC-18 200 мг1003.5 Обнаружение метаболитов флавоноидов горянки в моче крысОсновным преимуществом применения тандемной масс-спектрометрииявляется получение дополнительной информации, которая позволяет доказатьструктурноесходствовеществ,определяемыхвбиосредах(предположительных метаболитов), с исходными веществами, основываясь назакономерностях фрагментации целевых соединений и удерживании.
Данныйметод является одним из основных для доказательства структуры метаболитовпо причине крайне незначительного количества вещества и сложностиматрицы, что делает невозможным применение таких методов, как ЯМР иинфракрасная спектроскопия.Дляобнаруженияметаболитовфлавоноидовгорянкиметодомтандемной масс-спектрометрии высокого разрешения в разд. 3.1 провелидетальное изучение фрагментации имеющихся в наличии стандартов:икариина, икаритина, икаризидов I, II, эпимединов А, В, С.При изучении фрагментации имеющихся стандартных образцовикариина,следующиеикаритина,икаризидов I, II,закономерности:дляэпимединов А, В, Сфлавоноидовгорянкивыявилихарактернопоследовательное отщепление углеводных заместителей, при этом сначалапроисходит потеря углеводных групп в положении С3, затем в положении С7собразованиемион-продуктасm/z 369,1333,аперегруппировкаизопентеновой группы в положении С8 приводит к появлению ион-продукта сm/z 313,0707.Такимобразом,m/z 369,1333и313,0707являютсяхарактеристичными массами при обнаружении флавоноидов горянки иотнесении соединений к данному классу.Метод масс-спектрометрического детектирования с использованиемнейтральных потерь (132,0423, 146,0579 и 162,0528 Да, указывают наотщепление ксилозного, рамнозного и глюкозного остатков, соответственно),позволил значительно упростить обнаружение метаболитов флавоноидовгорянки, так как выбор иона для фрагментации определяется при МСсканировании по предварительно установленным величинам нейтральных101потерь.Используяспектрометрическогокомпонентовпредложенныйнамидетектирования,горянки:икариина,методпомимотандемногоосновныхикаритина,масс-действующихикаризидов I, II,эпимединов А, В, С (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
