Определение флавоноидов горянки и их метаболитов методом тандемной хроматомасс-спектрометрии высокого разрешения (1105645), страница 8
Текст из файла (страница 8)
Далее отмывали впроточнойводеспоследующиммногократнымополаскиваниемдистиллированной водой. После высушивания в сушильном шкафу притемпературе 150 С посуду хранили герметично закрытой без доступа влаги.492.6.2 Подготовка деионизованной водыС использованием дистиллятора получали дистиллированную воду,применяемую для приготовления элюентов, затем её пропускали черезустановку для получения деионизованной воды, при этом удельноеэлектрическое сопротивление составляло не менее 18 МОм·см. Далее спомощью рН-метра определяли значение рН полученной воды, котороенаходилось в пределах от 5,4 до 6,6.2.6.3 Приготовление фосфатного буферного раствораНа аналитических весах взвешивали 14,3 г гидрофосфата натрия, 5,5 гдигидрофосфата калия и растворяли в 100 мл деионизованной воды.Иономером лабораторным измеряли pH буферного раствора.
Данныйпоказатель должен быть в пределах от 6,5 до 6,9. Если значение pHпревышало 6,9 – его понижали путем добавления дигидрофосфата калия.Так как фосфатный буфер подвержен бактериальному загрязнению,при котором он мутнеет, для его стабилизации добавляли азид натрия вконцентрации 0,1%.2.6.4 Приготовление карбонатного буферного раствораНа аналитических весах взвешивали 7,5 г гидрокарбоната калия, 7,5 гкарбоната калия и растворяли в 100 мл деионизованной воды.Иономером лабораторным измеряли pH буферного раствора.
Данныйпоказатель должен быть в пределах от 9,9 до 10,4. Если значение pHпревышало 10,4 – его понижали путем добавления гидрокарбоната калия.2.6.5 Приготовление растворов стандартных образцовРастворышестифлавоноидовгорянки(икариина,икаритина,икаризидов I, II, эпимединов А, B) и куместрола с концентрациями 1 мг/млготовили растворением точных навесок 10 мг в 10 мл метанола, после чегоразбавлением готовили аттестованную смесь (АС) с концентрацией50икариина, икаритина, икаризида I, икаризида II, эпимедина А и эпимедина В0,1 мг/мл.2.6.6 Приготовление градуировочных растворов икариина,икаритина, икаризида I, икаризида II, эпимедина А и эпимедина В вметиловом спиртеИз АС икариина, икаритина, икаризида I, икаризида II, эпимедина А иэпимедина В с концентрацией 0,1 мг/мл путем смешивания и кратногоразбавления метиловым спиртом готовили десять ГР, концентрацииприготовления которых указаны в табл. 7.ГР готовили в тот же день, что и АС.Таблица 7 – Концентрации ГР икариина, икаритина, икаризида I, икаризида II,эпимедина А и эпимедина В в метиловом спиртеПриготавливаемыйраствор№№ КонцентрацияГРкомпонента,мгмлРаствор АС или ГР,используемый для разведенияКонцентрацияОбъём,компонента,млмгмлМетиловый спиртОбъём,мл15,0×10-20,15,05,022,5×10-20,12,57,531,0×10-20,11,09,045,0×10-30,10,59,551,0×10-31,0×10-21,09,065,0×10-45,0×10-31,09,071,0×10-41,0×10-31,09,085,0×10-55,0×10-41,09,091,0×10-51,0×10-41,09,0101,0×10-61,0×10-51,09,02.6.7 Приготовление подвижной фазы для высокоэффективнойжидкостной хроматографииДляпроведенияхроматографическогодвухкомпонентная подвижная жидкая фаза:анализаиспользовалась51– компонент А – 0,1%раствормуравьинойкислотывсмесидеионизированной воды с ацетонитрилом марки «для ВЭЖХ» в соотношениикомпонентов 95:5 (объем.);– компонент В – 0,1% раствор муравьиной кислоты в ацетонитрилемарки «для ВЭЖХ».Для приготовления 0,1% раствора муравьиной кислоты в смесидеионизированной воды с ацетонитрилом (в соотношении компонентов95:5 объем.) в мерном цилиндре емкостью 1000 мл смешивали 1,0 млмуравьиной кислоты, 50,0 мл ацетонитрила марки «для ВЭЖХ» и затемдоводили до метки деионизованной водой.
Приготовленный раствор плотнозакрывали крышкой и тщательно перемешивали.Для приготовления 0,1% раствора муравьиной кислоты в ацетонитрилев 1000 мл ацетонитрила вносили 1,0 мл муравьиной кислоты и тщательноперемешивали раствор.2.7 Техника эксперимента2.7.1 Схема эксперимента по исследованиюпроцессов масс-фрагментации и оптимизации энергии соударенийРастворы куместрола (рис.
5) и шести СО флавоноидов горянки:икариина, икаритина, икаризида I, икаризида II, эпимедина А и эпимедина В(табл. 8)сконцентрациями10мкг/млготовилипоследовательнымразбавлением метиловым спиртом исходных растворов с концентрациями1 мг/мл, приготовленных согласно разд. 2.6.5.OHHOOOOРис. 5. Структурная формула куместрола (брутто-формула C15H8O5, M=268,0372).52Таблица 8 – Структурные формулы основных флавоноидов горянки№п/пНазваниесоединенияR1R2БруттоформулаМоноизотопнаямасса, Да1ИкариинrhagluC33H40O15676,23622ИкаритинHHC21H20O6368,12603Икаризид IHgluC27H30O11530,17884Икаризид IIrhaHC27H30O11514,18395Эпимедин Arha-(1-2)glugluC39H50O20838,28956Эпимедин Вrha-(1-2)xylgluC38H48O19808,2790Примечание: rha – рамнозил, glu – глюкозил, xyl - ксилозилОпределение проводили с использованием источников ионов с ИЭР иХИАД, соединённых с гибридным масс-спектрометром QExactive сорбитальной ионной ловушкой высокого разрешения.
Ток коронного разрядасоставлял2 мкА(вслучаеиспользованияХИАД),напряжениенакапилляре – 3,5 кВ; температура капилляра – 320 °С; температура нараспылителе – 280 °С; скорость потока распыляющего газа (азот) –0,40 л/мин; скорость потока вспомогательного газа (азот) – 0,1 л/мин;скоростьпотокагаза-осушителя(азот) –0,05 л/мин.Детектированиеосуществляли в диапазоне масс 100–1500 Да и 80–1200 Да при регистрацииположительно и отрицательно заряженных ионов, соответственно, сразрешением 35 000 (на половине высоты) и точностью определения масс5 миллионных долей (м.д.). Масс-спектры фрагментных ионов получаливысокоэнергетической диссоциацией соударением (HCD), варьируя энергиив диапазоне 10–70 В c шагом 10 В.
Обработку данных проводили с53применениемпрограммногообеспеченияXсaliburверсии 2.2.Предполагаемые структуры фрагментных ионов действующего веществаполучали с помощью программ HighChem Mass Frontier версии 7.0 иHyperChem версии 7.Вкачествеподвижнойфазыиспользовали0,1%-ныйраствормуравьиной кислоты в смеси ацетонитрил/вода в соотношении 5 : 95 (об.) (А)и 0,1% раствор муравьиной кислоты в ацетонитриле (В), приготовленныесогласно разд. 2.6.7. Хроматографическое разделение веществ проводили врежиме градиентного элюирования: 0−2 мин — 5% В; 15 мин — 95% В; 15–18 мин — 95% В; 19−23 мин — 5% В.
Температура колонки составляла30 °С, скорость потока подвижной фазы – 0,5 мл/мин. Время анализа сучетом стабилизации системы перед вводом следующего образца составляло23 мин. Объём вводимой пробы – 1 мкл.2.7.2 Схема эксперимента по определению флавоноидов горянкив растительных материалах и продуктах на их основеПодготовка проб. Отбирали 1 г исследуемого сырья (высушенногоэтанольного экстракта горянки коротконожковой (Epimedium brevicornum),гранулированного чая с экстрактом горянки корейской (Epimedium koreanum)и настойки из горянки корейской (Epimedium koreanum)) и добавляли 10 млэкстрагента (70% раствор этанола в воде).
Смесь нагревали до 35 °С на УЗВ втечение30 мин.Послеэтого1 млэкстрактаотбиралиизатемцентрифугировали 12 мин при 16 000 об/мин. Надосадочный слой жидкостиисследовали хроматомасс-спектрометрически.Условия работы масс-спектрометрического детектора. Условиямасс-спектрометрического детектирования приведены в табл.
9.Таблица 9 – Условия масс-спектрометрического детектированияНаименование параметраМасс-спектрометрический детекторЗначениеМасс-спектрометр высокого разрешенияQExactive с источником ионизации HESI-II54Наименование параметраРежим источника ионизацииЗначениеИонизация электростатическимраспылениемДетектирование в режиме мониторингаРежим детектированиявыбранных реакций (SRM) при регистрацииположительно заряженных ионовРазрешающая способностьТип ячейки соударительной диссоциации35000Ячейка высокоэнергетическойсоударительной диссоциации (HCD)Скорость потока газа-осушителя5 ед.Скорость потока вспомогательного газа10 ед.Скорость потока газа на распылителе40 ед.Напряжение на капилляре4.0 кВТемпература на распылителе280 СТемпература капилляра270 СПроцедуру калибровки масс-спектрометра с орбитальной ионнойловушкой проводили с использованием калибровочного раствора.
Для сбораи обработки масс-спектрометрических данных использовалась программаXcalibur версии 2.2.Условия хроматографического разделения.Подвижная фаза– компонент А – 0,1% раствор муравьиной кислоты всмеси деионизированной воды с ацетонитриломмарки «для ВЭЖХ» в соотношении компонентов 95:5(объем.);– компонент В – 0,1% раствор муравьиной кислоты вацетонитриле марки «для ВЭЖХ».Температура45 Стермостата колонкиОбъем ввода пробы5 мклВремя анализа15 мин55РежимградиентныйхроматографическогоэлюированияВремя, мин0,01,04,04,57,510,511,0Соотношение компонентовподвижной фазыА, %В, %80208020752560405955958020Скоростьпотока,мл/мин0,60,60,60,60,60,60,62.7.3 Схема эксперимента по разработке способа извлеченияосновных компонентов горянки из растительных материаловсверхкритическим диоксидом углеродаДля экстракции основных компонентов горянки использовали листьяEpimedium brevicornum из одной партии лекарственного растительногосырья.Листьягорянкиизмельчалидо6-8 мм,отбирали5,0 гиэкстрагировали при температурах от 40 до 60 °С с шагом 5 °С и давлениях от10 до 30 МПа с шагом 5 МПа в течение 15, 30 и 45 мин.
В качестве сорастворителяиспользовали80%-ныйэтанол.Скоростиподачисо-растворителя и углекислого газа составляли 3 и 7 г/мин, соответственно.Длясравнительнойоценкиэффективностиэкстракциисверхкритическим диоксидом углерода были также получены спиртовыеэкстракты ультразвуковым методом с использованием оптимизированныхпараметров, приведённых в работе [48].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
