Определение флавоноидов горянки и их метаболитов методом тандемной хроматомасс-спектрометрии высокого разрешения (1105645), страница 7

Просмтор этого файла доступен только зарегистрированным пользователям. Но у нас супер быстрая регистрация: достаточно только электронной почты!

Текст из файла (страница 7)

С помощью данной программы можнопроводитьфармакокинетическиеисследованияпроббиоматериалов,выявлять метаболиты целевого соединения и исследовать изменениясодержаний аналита и его метаболитов от времени в автоматическом режиме.Программный комплекс MetWorks фирмы «Thermo Scientific» (США)позволяет анализировать масс-спектральные данные в формате XcaliburRAW file и идентифицировать метаболиты, образующиеся в результатемодификаций известных целевых веществ при воздействии различных41ферментов организма. При проведении протеомных и метаболомныхисследованийбиопробдляизученияфармакологическихитоксикологических показателей используют программу статистического имасс-спектрального анализа массивов экспериментальных данных SIEVE.ACD/Labs версии 12.0 и ACD/Percepta позволяют по структуре соединенияпрогнозироватьегофармакологическиефизико-химические,свойства.Данныетоксикологическиепакетыприкладныхипрограммпредсказывают возможные метаболические процессы при воздействии насоединение ферментов семейства Цитохромов Р 450 и фармакокинетическиепараметры аналита при различных путях вывода из организма.ПрограммабиблиотечныйMassпоискFrontier7.0HighChemмасс-спектральныхпозволяетданных,проводитьрассчитыватьипредсказывать масс-спектральную фрагментацию для различных типовионизации и диссоциации молекулы целевого соединения.Данное программное обеспечение также может быть сопряжено ссистемами предиктивного метаболизма, позволяющими прогнозироватьвозможные биотрансформации любого соединения в организме человека илабораторных животных, такими как, например Meteor, разработаннойкомпанией LHASA (Logic and Heuristics Applied to Synthetic Analysis).Таким образом, внедрение в лабораторную практику современныхметодов хроматографии в сочетании с гибридной многомерной массспектрометрией высокого разрешения в комплексе со специализированнымпрограммным обеспечением для анализа данных может служить основойразработки методик определения метаболитов.*Внастоящеераспространеннымивремя*ВЭЖХ–УФметодамиконтроля*иКЗЭявляютсясодержаниясамымифлавоноидовврастительном сырье, экстрактах и продуктах на их основе.

Их выборобусловлендоступностью,простотойираспространенностьюв42аналитических лабораториях. Однако ограничением этих методов являетсянеобходимость использования СО.Использование ВЭЖХ в сочетании с масс-спектрометрическимдетектированием позволяет идентифицировать действующие веществагорянки, а также получить важную информацию об их структуре (например,молекулярную массу). Растения различных видов горянки отличаются посоставу флавоноидов, что и выясняется с использованием методовВЭЖХ-МС, ВЭЖХ-МС/МС. Кроме того, данные технологии можноприменятьвкачествечувствительныхиселективныхспособовколичественной оценки содержания флавоноидов.

Несмотря на высокуюцену данных методов и сложность для рутинного анализа, их с успехомиспользуют в изучении параметров фармакокинетики и метаболомике, приэтом простейшим и наиболее распространенным способом подготовкибиологическихпробявляетсяосаждениебелковиобессоливаниеорганическим растворителем.

Однако из-за сложного многокомпонентногосостава биологических проб, влияющего на процесс ионизации аналитов вмасс-спектрометре необходимо тщательно исследовать эффект матрицы, таккак он вносит значительный вклад в ошибку определения [175, 176].Подготовка образцов является одним из важных этапов в исследованиигорянки. Чаще всего для извлечения флавоноидов из растительного сырьяиспользуют экстракцию (метанолом и этанолом). Применение ультразвука имикроволнового поля позволяет уменьшить время экстракции и увеличитьэффективность.

В настоящее время в печати отсутствуют сведения,посвящённыеперспективнымисследованиямвыделенияактивныхкомпонентов из горянки с использованием растворителей, находящихся всверхкритическом состоянии, в том числе диоксида углерода. Однакосверхкритическая экстракция обладает рядом преимуществ по сравнению сдругими способами извлечения: обеспечиваются экологичность, быстротапроцесса,высокийвыходконечногопродукта;низкаятемпература43экстракции;исключаетсяпроблемаостаточногорастворителявэкстракте [177-182].В последнее время для идентификации действующих компонентовгорянки и их метаболитов в биологических образцах используется методВЭЖХ в сочетании с тандемной масс-спектрометрией высокого разрешенияи многомерной масс-спектрометрией с применением алгоритмов зависимогосканирования.

Однако обработка полученных инструментальных данныхтребует соответствующего программного обеспечения и больших временныхзатрат. Поэтому необходимо разработать селективный метод с высокойчувствительностью и экспрессностью для идентификации метаболитовфлавоноидов горянки в биологических образцах, который позволит не толькообезопасить применение людьми лекарственных растений традиционноймедицины, но и выявить, изучить пути метаболизма и биологическогодействия действующих веществ в живом организме.44Глава 2 Материалы и методы исследования2.1 Реактивы и материалыВ работе использовали следующие реактивы и материалы:кислота серная концентрированная («Sigma», США), калийдвухромовокислый («Sigma», США) – для подготовки посуды;метиловый спирт (метанол) и этиловый спирт (этанол) дляградиентной ВЭЖХ («Merck», Германия) – в качестве растворителя СО;ацетонитрил для градиентной ВЭЖХ («Merck», Германия),муравьиная кислота («Fluka», Германия) – для приготовления подвижныхфаз;DSC-18картриджи для сорбционного концентрирования (ТФЭ) HLB ивместимостью6 млсмассойсорбента200 мг(«Supelco»,Германия) – для подготовки биопроб;хлористый метилен («МедХимПром», Россия), диэтиловый эфир(«МедХимПром», Россия), трет-бутилметиловый эфир («Panreac», Испания),гексан («МедХимПром», Россия), изобутиловый спирт («LiChrosolv®»,Германия), изопропиловый спирт («LiChrosolv®», Германия), этилацетат(«Chromasolv®», Германия) – для проведения жидкостно-жидкостнойэкстракции;безводный дигидрофосфат калия («Merck», Германия) и 12-водныйгидрофосфат натрия («Merck», Германия) – для приготовления фосфатногобуферного раствора с pH 6,5;хлорид натрия («Sigma-Aldrich», Германия);концентрированная соляная кислота («ХимМед», Россия);карбонат и гидрокарбонат калия («ХимМед», Россия) – дляприготовления карбонатного буферного раствора с pH 10,0;бета-глюкуронидаза из E-coli K 12 (раствор в 50% глицерине,«Roche diagnostics GmbH», Германия) – для ферментативного гидролиза;45калибровочные растворы для QExactive и Orbitrap Fusion («ThermoScientific», США) – для калибровки масс-спектрометров.Все используемые реагенты и растворители были аналитическойстепени чистоты, растворы для подготовки проб готовили с применениемдеионизованной воды.2.2 Стандартные образцыВ работе использовали следующие СО:икариин («PhytoLab», Германия);икаритин («PhytoLab», Германия);икаризид I («PhytoLab», Германия);икаризид II («PhytoLab», Германия);эпимедин A («PhytoLab», Германия);эпимедин B («PhytoLab», Германия);эпимедин C («PhytoLab», Германия);куместрол («Sigma», США) в качестве внутреннего стандарта.Содержание основных веществ в СО составляло не менее 95%.2.3 Исследуемые образцыВ работе исследовали следующие образцы растительных материалов икоммерчсеких продуктов на основе горянки:высушенный этанольный экстракт горянки коротконожковой(Epimediumномерbrevicornum,партии:С20110705,Прикладнаябиотехнология, Россия), представляющий собой порошок горчичного цвета;гранулированный чай с экстрактом горянки корейской (Epimediumkoreanum, производитель: государственная корпорация здравоохранения«Маннён», Северная Корея);настойкаизгорянкикорейской(Epimediumkoreanum,государственная корпорация здравоохранения «Маннён», Северная Корея),представляющая собой вязкую жидкость тёмко-коричневого цвета;46высушенныетемпературе35-38 °Свтенивлистьяпроветриваемомгорянкипомещениикоротконожковойпри(Epimediumbrevicornum), с востока Китая.2.4 Оборудование, вспомогательные устройства, средстваизмерений и программное обеспечениеВработеиспользовалиследующееоборудованиеисредстваизмерений:высокоэффективныйоснащенныйжидкостнойавтосамплеромDionexхроматографUltimate 3000,Ultimate 3000 RSAutosampler,градиентным насосом Dionex Ultimate 3000 RS Pump, дегазатором и блокомдля термостатирования хроматографической колонки, соединенным сгибридныммасс-спектрометромQExactiveсквадрупольныммасс-анализатором и с орбитальной ионной ловушкой высокого разрешения(«Thermo Scientific», США), с возможностью использовать источникиионизации IonMax HESI-II и APCI;высокоэффективныйоснащенныйавтосамплеромжидкостнойDionexхроматографUltimate 3000,Ultimate 3000 RSAutosampler,градиентным насосом Dionex Ultimate 3000 RS Pump, дегазатором и блокомдля термостатирования хроматографической колонки, соединенный стрибридным масс-спектрометром Orbitrap Fusion с квадрупольным массанализатором, с линейной ионной ловушкой и с орбитальной ионнойловушкой высокого разрешения («Thermo Scientific», США) и источникомионизации EASY-Max-NGTM;экстракцию сверхкритическим диоксидом углерода осуществлялина лабораторной установке производства компании «Waters Corporation»,США, модели SFE-100;взвешивание навесок проводили на лабораторных электронныхвесах XP Analytical модель XP-56 с погрешностью ± 0,000001 г и диапазономвзвешивания от 0,00001 до 52,0 г («Mettler Toledo», Швейцария);47для отбора жидкостей использовали дозаторы переменного объема10-100; 100-1000; 1000-5000 мкл и наконечники для дозаторов вместимостью0,1-10,0; 10,0-100,0; 50,0-1000,0; 1000,0-10000,0 мкл («Biohit», Германия).Вспомогательное оборудование, применяемое при исследовании:для получения азота, используемого в качестве распыляющего ивспомогательного газа, применяли генератор Genius 1022 («Peak Scientific»,Шотландия);хроматографическоеразделениеосуществлялинаколонкеHypersil Gold aQ, длиной 150 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, размеромзерна сорбента 3 мкм с предколонкой («Thermo Scientific», США);для получения деионизованной воды использовали дистиллятор«ДЭ-4-2М» (Россия), установку NANOPure («Thermo Scientific», США);иономер лабораторный, тип И-160МИ (ООО «Измерительнаятехника», Россия);дляSNOL 67/350,(50-350) °Сподготовкидиапазон(«СНОЛ»,обеспечивающуюпробприменялиавтоматическогоРоссия);шкафсушильныйрегулированияцентрифугутипатемпературнизкоскоростную,максимальную скорость вращения до4400 об./мин(«Eppendorf», Германия); орбитальный шейкер с максимальной скоростьювращения 3000 об./мин производства («IKA», Германия); фильтровальныенасадки на шприц Spartan диаметром 30 мм с размером пор 0,20 мкм и шприцSpartan вместимостью 10 мл («Whatman», Великобритания); целлюлозныефильтры с размером пор 0,45 мкм («Macherey-Nagel», Германия);для перемешивания растворов применяли ультразвуковую ванную(УЗВ) («Серьга», Россия);для упаривания использовали упариватель-концентратор на 6портов («Supelco», США);для хранения проб, реактивов и стандартных образцов применялихолодильник медицинский с морозильной камерой («SANYO», Япония);48дляТФЭиспользоваливакуумнуюустановку(Манифолд)(«Supelco», Германия).В работе применяли следующее программное обеспечение:регистрацию и обработку хроматограмм проводили с помощьюпрограммных пакетов Xсalibur версии 2.2 и 3.0 («Thermo Scientific», США);предполагаемыеструктурыфрагментныхионованалитовполучали с помощью программ HighChem Mass Frontier версии 7.0 иHyperChem версии 7;с использованием программы метаболомного анализа MetWorksверсии 1.3обнаружилиметаболиты,образующиесяврезультатемодификаций известных целевых веществ;с помощью программных комплексов ACDLabs (biotransformationmaps) версии 12.0 и ACDLabs/Percepta версии 12.0 предсказывали возможныеметаболические процессы при воздействии на соединения ферментовсемейства Цитохромов Р 450.2.6 Приготовление рабочих и буферных растворовПеред взвешиванием или разбавлением растворы и субстанциинагревали до комнатной температуры.2.6.1 Подготовка посудыПосуда, используемая для приготовления растворов и аналитическихизмерений, замачивалась на (3-4) часа в свежеприготовленном 3%-номрастворе двухромовокислого калия в серной кислоте (5 г двухромовокислогокалия на 100 мл концентрированной серной кислоты).

Характеристики

Список файлов диссертации