Определение флавоноидов горянки и их метаболитов методом тандемной хроматомасс-спектрометрии высокого разрешения (1105645)
Текст из файла
Московский государственный университет имени М.В. ЛомоносоваХимический факультетКафедра аналитической химииНа правах рукописиШЕВЛЯКОВА ОЛЕСЯ АЛЕКСАНДРОВНАОпределение флавоноидов горянки и их метаболитов методомтандемной хроматомасс-спектрометрии высокого разрешения02.00.02 – Аналитическая химияДиссертация на соискание ученой степеникандидата химических наукНаучный руководитель:к.х.н., с.н.с., Родин И.А.Москва – 20162ОГЛАВЛЕНИЕВВЕДЕНИЕ .............................................................................................................. 6Глава 1 Обзор литературы .................................................................................... 121.1 Состав смеси флавоноидов горянки .............................................................. 121.2 Методы извлечения флавоноидов из горянки ..............................................
141.3 Выделение отдельных биоактивных компонентов горянки ....................... 161.4 Методы определения целевых аналитов....................................................... 191.4.1 Тонкослойная хроматография .................................................................... 191.4.2 Капиллярный электрофорез ........................................................................
201.4.3 Газовая хроматография................................................................................ 251.4.4 Высокоэффективная жидкостная хроматография .................................... 261.5 Определение флавоноидов горянки в биопробах ........................................ 321.6 Исследования метаболизма флавоноидов горянки ..................................... 34Глава 2 Материалы и методы исследования ......................................................
442.1 Реактивы и материалы .................................................................................... 442.2 Стандартные образцы ..................................................................................... 452.3 Исследуемые образцы..................................................................................... 452.4 Оборудование, вспомогательные устройства, средства измерений ипрограммное обеспечение .................................................................................... 462.6 Приготовление рабочих и буферных растворов ..........................................
482.6.1 Подготовка посуды ...................................................................................... 482.6.2 Подготовка деионизованной воды ............................................................. 492.6.3 Приготовление фосфатного буферного раствора ..................................... 492.6.4 Приготовление карбонатного буферного раствора ..................................
492.6.5 Приготовление растворов стандартных образцов .................................... 492.6.6 Приготовление градуировочных растворов икариина, икаритина,икаризида I, икаризида II, эпимедина А и эпимедина В в метиловомспирте ..................................................................................................................... 502.6.7 Приготовлениеподвижнойфазыдлявысокоэффективнойжидкостной хроматографии ................................................................................. 5032.7 Техника эксперимента ....................................................................................
512.7.1 Схемаэкспериментапоисследованиюпроцессовмасс-фрагментации и оптимизации энергии соударений .......................................... 512.7.2 Схема эксперимента по определению флавоноидов горянкиврастительных материалах и продуктах на их основе ........................................ 532.7.3 Схема эксперимента по разработке способа извлечения основныхкомпонентов горянки из растительных материалов сверхкритическимдиоксидом углерода .............................................................................................. 552.7.4 Схемаэкспериментапоразработкеспособаопределения действующих соединений горянки в биологических пробах .... 562.7.5 Схемаэкспериментапоразработкеспособаобнаруженияфлавоноидов горянки в растительном сырье и продуктах на его основе .......
572.7.6 Получение биоматериала ............................................................................ 58Глава 3. Результаты и обсуждение ...................................................................... 603.1 Разработка способа определения флавоноидов горянки методомВЭЖХ-МС/МС ...................................................................................................... 603.1.1 Разработка способа идентификации икариина ......................................... 603.1.2 Разработкаспособаколичественногоопределенияфлавоноидов горянки в режиме регистрации выбранных ионныхпереходов ............................................................................................................... 663.2 Разработка способа группового обнаружения флавоноидов горянки .......
773.3 Разработка способа экстракции флавоноидов из горянки .......................... 863.4 Разработка способа определения флавоноидов горянки в моче ................ 893.5 Обнаружение метаболитов флавоноидов горянки в моче крыс............... 100ВЫВОДЫ ............................................................................................................. 106СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ ......................................... 108ПРИЛОЖЕНИЕ А.
.............................................................................................. 133ПРИЛОЖЕНИЕ Б ................................................................................................ 1434СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙCID (ДАС)– collisioninduceddissociation(диссоциация,активированная соударениями)SRM (МВР)– selectedreactionmonitoring(мониторингзаданных(выбранных) реакций)HCD (ДАСПЭ)– higher-energyC-trapdissociation(диссоциация,активированная соударениями при повышенной энергии)АС– аттестованная смесьБАВ– биологически активные веществаБСТФА– бис(триметилсилил)-N,O-трифторацетамидВЭЖХ– высокоэффективная жидкостная хроматографияВЭТСХ– высокоэффективная тонкослойная хроматографияГР– градуировочный растворГХ– газовая хроматографияДМД– диодно-матричный детекторЖЖЭ– жидкостно-жидкостная экстракцияИК– инфракрасная спектроскопияИЭР– ионизация электрораспылениемКЗЭ– капиллярный зонный электрофорезКЭ– капиллярный электрофорезКЭХ– капиллярная электрохроматографиям.д.– миллионные долиМС– масс-спектрометрияМС/МС– тандемная масс-спектрометрияМСТФА– N-метил-N-(триметилсилил)трифторацетамидСК-СО2– экстракция сверхкритическим диоксидом углеродаСО– стандартный образецТМС– триметилсилильныйТСХ– тонкослойная хроматографияТФЭ– сорбционное концентрирование5УЗВУФ– ультразвуковая ванна– ультрафиолетовыйдетектор(ультрафиолетовоедетектирование)ХИАД– химическая ионизация при атмосферном давленииЯМР– ядерный магнитный резонанс6ВВЕДЕНИЕАктуальность проблемы.Наиболее древнее и актуальное направление фармацевтической химиисвязано с созданием лекарственных средств и биологически активныхдобавок к пище на основе растительного сырья, в состав которого входятсотни или даже тысячи различных соединений.
Терапевтический эффект, какправило, обусловлен синергизмом нескольких компонентов.Исследование качественного и количественного состава компонентоврастительного сырья и препаратов на его основе проводится как при поискеновых биологически активных соединений и реализуемых с их помощьюфармакологических эффектов, так и при контроле качества сырья и готовыхлекарственных форм известных препаратов. Государственной ФармакопеейРФ регулируется лишь групповое определение флавоноидов методамититриметрии и спектрофотометрии, в то время как ввиду различающихсябиологических эффектов разных представителей этого ряда необходима ихиндивидуальнаяидентификацияврастительномсырье.Согласнофедеральному закону №61-ФЗ «Об обращении лекарственных средств» прирегистрацииновыхметаболизмаипрепаратовнеобходимофармакокинетикипроводитьактивныхисследованиефармакологическихингредиентов.Открытиеновыхфармакологическихэффектовфлавоноидовинициировало более пристальное внимание исследователей к растениям родаEpimedium, широко используемым в рамках традиционной медицины вКитае, Корее и на Дальнем Востоке.
В последние годы опубликованобольшоеколичестворабот,посвященныхисследованиюсоставафлавоноидов, характерных для некоторых представителей этого рода. Приэтом состав флавоноидов горянки исчерпывающим образом изучен не был.Основными действующими веществами горянки являются флавоноиды:икариин, икаритин, икаризиды I, II, эпимедины A, В, C, обладающие7широкимспектромандрогенной,биологическойактивности:антидепрессантной,иммуномодулирующей[1-3].противоопухолевой,антиостеопорознойИспользованиеивысокоэффективнойжидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в сочетании с тандемным массспектрометрическим детектированием высокого разрешения обеспечиваетнадежную идентификацию не только действующих веществ горянки, но и ихметаболитов, благодаря высокоселективному разделению исследуемыхсмесейиинформативнымспектрам.Ограниченностьдоступнойизлитературы информации о составе флавоноидов растений рода Epimedium иих масс-спектрометрических характеристиках не позволяла установитьобщиезакономерностинеобходимостьихфрагментации.углубленногоТакимобразом,возниклахроматомасс-спектрометрическогоисследования комплекса биоактивных соединений горянки.
Значительнаявариабельность состава экстрактивных компонентов в различных образцахрастительного сырья обусловливает необходимость разработки селективного,чувствительного и экспрессного способа определения активных компонентовгорянки в растительном сырье и их метаболитов в биологических образцах.Цели и задачи исследования.Цель работы состояла в разработке способа определения биологическиактивных веществ растений рода Epimedium методом высокоэффективнойжидкостной хроматографии в сочетании с тандемной масс-спектрометриейвысокого разрешения и апробация разработанного подхода при обнаруженииметаболитов флавоноидов горянки с использованием полученной изэкспериментальных данных информации о путях фрагментации исследуемойгруппы веществ.Достижение поставленной цели предусматривало решение следующихзадач:– изучение процессов ионизации и путей фрагментации исследуемойгруппы веществ в условиях ВЭЖХ в сочетании с тандемной масс-8спектрометрией высокого разрешения, оптимизация условий получениямасс-спектров;– обоснованиережимаэкстрагированияфлавоноидовгорянкисверхкритическим диоксидом углерода;– выборусловийхроматографическогоразделенияисследуемойгруппы веществ;– разработка алгоритма обнаружения флавоноидов горянки на основезакономерностей фрагментации;– выбор условий подготовки биологических проб, обеспечивающихэффективное извлечение определяемых соединений, изучение влиянияматрицы на степень ионизации;– обнаружение метаболитов биологически активных веществ горянки вмоче лабораторных животных.Научная новизна.1.
Характеристики
Тип файла PDF
PDF-формат наиболее широко используется для просмотра любого типа файлов на любом устройстве. В него можно сохранить документ, таблицы, презентацию, текст, чертежи, вычисления, графики и всё остальное, что можно показать на экране любого устройства. Именно его лучше всего использовать для печати.
Например, если Вам нужно распечатать чертёж из автокада, Вы сохраните чертёж на флешку, но будет ли автокад в пункте печати? А если будет, то нужная версия с нужными библиотеками? Именно для этого и нужен формат PDF - в нём точно будет показано верно вне зависимости от того, в какой программе создали PDF-файл и есть ли нужная программа для его просмотра.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
