Определение флавоноидов горянки и их метаболитов методом тандемной хроматомасс-спектрометрии высокого разрешения (1105645), страница 2
Текст из файла (страница 2)
Изучены процессы формирования масс-спектров биологическиактивных компонентов горянки. Установлены закономерности, связывающиеструктуру икариина, икаритина, икаризидов I, II, эпимединов А, В(последовательность углеводных заместителей) со значениями m/z в спектрахвусловияхионизацииэлектрораспылением(ИЭР).Обнаруженыхарактеристичные сигналы в масс-спектрах (m/z 369,1333 и 313,0707),позволяющие относить неизвестные флавоноиды горянки к данному классусоединений.2. Разработанспособизвлеченияфлавоноидовгорянкисверхкритическим диоксидом углерода, обеспечивающий более эффективноеизвлечение (в 2,5 раза) определяемых соединений из растительныхматериалов и продуктов на их основе по сравнению с жидкостнойэкстракцией этанолом под действием ультразвука.3. Разработан селективный способ определения икариина, икаритина,икаризидов I, II, эпимединов А, В, С в растительном сырье и продуктах наегоосновесиспользованиеммасс-спектрометрического(МС)9детектирования в режиме регистрации выбранных ионных переходов,характеризующийсяселективностью.низкимипределамиПродемонстрированаобнаружениявозможностьивысокойпримененияэтогоспособа для контроля качества продуктов на основе горянки.4.
Выбраныусловияподготовкипробмочи,обеспечивающиемаксимальную степень извлечения аналитов (93-98%) и позволяющиеминимизировать влияние матрицы (матричный фактор составляет 0,94-0,98),нааналитическийсигналприсорбционномконцентрированиинакартриджах, заполненных модифицированным полимером стирола.5. Предложеныспособдетектированияфлавоноидовгорянкииалгоритм, позволяющие проводить обнаружение структурных фрагментовфлавоноидовгорянкинаоснованиизакономерностейфрагментации,заключающийся в получении тандемных масс-спектров в режиме зависимогосканированияионов-продуктовспредварительноустановленнымизначениями нейтральных потерь (m/z 132,0423, 146,0579 и 162,0528).6. Применение разработанного подхода позволило обнаружить шестьметаболитов, ранее не описанных в литературе, в моче крыс и предположитьих возможные структуры, соответствующие полученным результатам сиспользованиемпрограммACDLabs/biotransformationmaps,ACDLabs/Percepta, MetWork.Практическая значимость.
Разработанный способ апробирован приконтроле качества растительного сырья и продуктов на его основе. Показано,что использование метода ВЭЖХ-МС/МС позволяет проводить надежноеобнаружение и оценивать содержание икариина, икаритина, икаризидов I, II,эпимединов А, В, С – основных действующих компонентов различных видовгорянки,чтоможетбытьиспользованодлявыявленияфактовфальсификации растительного сырья и лекарственных средств на его основе.На основании полученных результатов разработана, аттестована ивнесена в реестр аттестованных методик измерения Федерального агентствапо техническому регулированию и метрологии «Росстандарт» методика10измерений содержания икариина, икаритина, икаризида I, икаризида II,эпимедина А, эпимедина В и эпимедина С в биологически активныхдобавках методом высокоэффективной жидкостной хроматографии сприменениемтандемноймасс-спектрометрии(№6.00163/2-28-2016от28.03.16).На защиту выносятся следующие положения:1.
Исследованиефлавоноидовпоказывает,закономерностейгорянкичтоввусловияхформированиямасс-спектровэлектрораспылительноймасс-спектрахданныханалитовионизацииприсутствуютхарактеристичные сигналы, позволяющие проводить групповое обнаружениесоединений, относящихся к данному классу.2. Использованиеэкстрагированияфлавоноидовгорянкисверхкритическим диоксидом углерода увеличивает степень извлечения в 2,5раза по сравнению с жидкостной экстракцией.3.Разработаннаяикаритина,икаризида I,методикаизмеренийикаризида II,содержанияэпимедина А,икариина,эпимедина Виэпимедина С в растительных продуктах на основе горянки методом ВЭЖХМС/МС позволяет снизить пределы обнаружения и повысить селективностьопределения аналитов.4. Разработанный способ подготовки проб мочи обеспечивает высокуюстепень извлечения аналитов и позволяет минимизировать влияние матрицына ионизацию определяемых соединений.5.
Разработанный алгоритм обнаружения флавоноидов горянки наосновании закономерностей формирования масс-спектров стандартныхобразцоввеществизвестнойструктурыпозволяетвыявлятьранеенеизвестные метаболиты и делать предположения о возможных структурахобнаруженных соединений.Апробация работы. Основные результаты работы представлены наII Всероссийской конференции c международным участием «Современныепроблемы химической науки и фармации», посвящённой 85-летию со дня11рождения В.А.
Кухтина (г. Чебоксары, 2014 г.), Всероссийской конференции«Теорияипосвященнойпрактикахроматографии»памятипроф.смеждународнымМ.С. Вигдергаузаучастием,(г. Самара, 2015 г.),VI Российско-корейской конференции «Современные достижения химиибиологически активных веществ и биотехнологии» (г. Новосибирск, 2015 г.),IX Всероссийской научной конференции с международным участием ишколе молодых учёных «Химия и технология растительных веществ»(г. Москва, 2015 г.), I Всероссийской конференции с международнымучастием «Химический анализ и медицина» (г. Москва, 2015 г.).Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 статей в журналах,рекомендованных ВАК, и 5 тезисов докладов.Структура и объем работы.
Диссертация состоит из введения, обзоралитературы, двух глав экспериментальной части, общих выводов и спискацитируемойлитературы.Материализложенна132страницахмашинописного текста (без учета приложения), содержит 29 рисунков и21 таблицу, в списке цитируемой литературы 214 источников. Приложениевключает 7 рисунков, 1 таблицу и 1 методику на 47 страницах.12Глава 1 Обзор литературы1.1 Состав смеси флавоноидов горянкиГорянка (лат.
Epimedium) — род многолетних травянистых растенийсемейства Барбарисовые, включает в себя более 60 видов. Встречаетсяисключительно в Восточном полушарии, где заселяет предгорья Европы,Кавказа, Турции, Японии и Китая. В Северо-Западной Африке найден лишьодин вид. В природе горянка произрастает во влажных горных лесах или нагорных отрогах [4, 5].В настоящее время у растений рода Epimedium обнаружены следующиесвойства:нормализуютмочеиспускание,устраняютголовокружение,приводят в норму обмен жидкости в организме, омолаживают организм,устраняют усталость, снимают стресс [6-15].
При этом в течение длительноговремени в медицине используются лишь немногие виды горянки. Согласнокитайской фармакопее [16], высушенные надземные части Epimediumbrevicornu Maxim., Epimedium sagittatum Maxim., Epimedium pubescensMaxim., Epimedium wushanense T.S. Ying и Epimedium koreanum Nakaiсодержат наиболее высокие концентрации флавоноидов, которые являютсяважнейшими функционально значимыми соединениями, присутствующими вэтих растениях, и обладают биологической активностью: антиопухолевой,андрогенной,антидепрессантной,антиостеопорознойииммуномодулирующей [17-29]. Основные действующие компоненты горянкипредставляютсобойпренилированныедигликозидыкемпферола,отличающиеся молекулами сахаров. В табл.
1 представлены структурысамых распространённых флавоноидов растений рода Epimedium.Горянку широко используют в фитомедицине, поэтому для разработкиметодик идентификации, количественной оценки содержаний и контролякачества растительного сырья, экстрактов и коммерческих продуктоввыполнено значительное число работ. Наиболее популярными методамиопределениядействующихкомпонентовгорянкисталиВЭЖХи13капиллярный электрофорез. Газовую хроматографию (ГХ) для исследованияфлавоноидов применяют реже жидкостной, так как данные вещества имеютзначительную массу, малую термическую стабильность и не обладаютлетучестью, в связи, с чем требуется дериватизация, увеличивающаяпродолжительность анализа [30].Таблица 1 – Структурные формулы основных флавоноидов горянки№п/пСоединениеR1R2R3R4R5НHCH2CH=C(CH3)2НCH3glugluCH2CH=C(CH3)2НCH33АнгидроикаритинАнгидроикаритин3,7-ди-О-глюкозидБаохуозид IrhaНCH2CH=C(CH3)2HCH34Баохуозид IIrhaHCH2CH=C(CH3)2HH5Баохуозид VIIrha(4-1)gluHCH2CH=C(CH3)2HCH36Гександразид ЕglugluCH2CH=C(CH3)2НH7Гександразид Frha(3-1)glugluCH2CH=C(CH3)2НCH38Икаризид IHgluCH2CH=C(CH3)2НCH39Икаризид IIrhaHCH2CH=C(CH3)2НCH310ИкариинrhagluCH2CH=C(CH3)2НCH311Икаризозид Сrha(2-1)glugluCH2CH=C(CH3)2НН12ИперинКемпферол-3-ОрамнозидgalHHOHOHrhaНHННgluCH2CH=C(CH3)2НCH3gluCH2CH=C(CH3)2НCH3HCH2CH=C(CH3)2OHCH3HCH2CH=C(CH3)2НCH3gluCH2CH=C(CH3)2НCH3HCH2CH=C(CH3)2HCH3121314Каохуозид А15Каохуозид В16Каохуозид C17Корепимедозид А18Корепимедозид С192”-О-рамнозиликаризид IIrha(1-4)(OAc)(1-3)glu(1-4)(OAc)(1-6)(OAc)rha(1-4)(OAc)(1-3)glu(1-4)(OAc)(1-6)(OAc)rharha(1-4)(OAc)(1-3)glu(1-4)(OAc)rha(1-4)(OAc)(1-3)glurha14№п/пСоединениеR1R2R3R4R520Сагиттатозид Arha(2-1)gluHCH2CH=C(CH3)2HCH321Сагиттатозид Вrha(2-1)xylHCH2CH=C(CH3)2HCH322Эпимедин Arha-(1-2)glugluCH2CH=C(CH3)2НCH323Эпимедин Вrha-(1-2)xylgluCH2CH=C(CH3)2НCH324Эпимедин Сrha-(1-2)rhagluCH2CH=C(CH3)2НCH325Эпимедозид АrhagluCH2CH=C(CH3)2НHНgluCH2CH=C(CH3)2rha(1-4)(OAc)27Эпимедокореанозид IgluCH2CH=C(CH3)2(1-3)glu(1-4)(OAc)Примечание: Ac = ацетил, glu = глюкозил, rha = рамнозил, xyl = ксилозил.НHНCH326Эпимедозид СИзучая механизмы биологической активности растений и развиваяметодыихопределения,исследователисталкиваютсяспроблемойтруднодоступности СО этих веществ [31].
Поэтому дальнейшее изучениевлияния флавоноидов на живые организмы напрямую зависит от развитияметодоввыделения,разделения,идентификациииколичественногоопределения действующих компонентов в горянке.1.2 Методы извлечения флавоноидов из горянкиЭтап подготовки проб является одним из важных этапов в развитиианалитическихметодов дляанализа лекарственных растений [32-34].Оптимальный метод экстракции позволяет более полно исследовать составосновных компонентов горянки.В качестве экстрагента для извлечения флавоноидов из горянкииспользуют воду [35], смеси метанол-вода [36], этанол-вода [37-49]. Болеепредпочтительным является экстрагирование 70%-ым этанолом [37-39, 41,43, 45, 48]. Применяют трудоёмкие способы, требующие достаточно высокихтемператур: кипячение и экстрагирование в аппарате Сокслета. Так,15предложен метод экстрагирования пяти гликозидов флавоноидов горянки(икариин, эпимедин А, В, C и иперин) из высушенных листьев принагревании (80 °С) с 70%-ным этанолом с обратным холодильником втечение 3 ч [38].
После охлаждения образец отфильтровывали и супернатантлиофилизировали. В работе [40] измельчённые листья экстрагировали50%-ным этанолом с обратным холодильником в течение 1 ч при 100 °С,фильтрат выпаривали досуха при пониженном давлении. Чэнь и др. [50]экстрагировали флавоноиды 50%-ным этанолом в течение 30 мин при 90 °С,фильтровали через 0,45 мкм микропористые мембраны, фильтрат собирали, атвёрдые вещества экстрагировали ещё 3 раза небольшим объёмом 50%-ногораствораэтанола.ФлавоноидыизвлекалииваппаратеСокслета:измельчённое растение смешивали с 50%-ным этанолом и выдерживали ваппарате при 90±2 °С в течение 90 и 240 мин [51].
Наилучшее извлечениедостигнуто при экстрагировании в течение 240 мин.Ультразвуковое оборудование широко используют в аналитическойхимии, в частности, при экстрагировании. Достоинствами его примененияявляются: уменьшение времени экстракции, снижение температуры иповышение полноты извлечения. Экстракцию проводят в ультразвуковомполе при 25 °С в течение часа [47], либо в течение 30 мин [41]. Показано, чтоизвлечение эпимедина А, В, С и икариина 50%-ным этанолом в течение30 мин при 50 °С с использованием ультразвуковой техники эффективнееэкстрагирования в аппарате Сокслета [48].Предложен быстрый метод для одновременного определения семифлавоноидов в горянке [47].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
