Определение флавоноидов горянки и их метаболитов методом тандемной хроматомасс-спектрометрии высокого разрешения (1105645), страница 3
Текст из файла (страница 3)
Подготовку проб проводили с использованиемжидкостнойэкстракцииподдавлением.Вкачестверастворителяиспользовали 70%-ный этанол, размер частиц составлял 0,3 – 0,4 мм,температура 120 °С, давление 10 МПа, время экстрагирования 10 мин. Затемэкстракт пропускали через мембранные фильтры с размером пор 0,2 мкм.Такую же методику экстрагирования использовали для одновременногоопределения 15 флавоноидов [39, 52].16Экстракция в микроволновом поле является хорошей альтернативойметодуСокслетаравномерностьиобработкепрогреванияультразвуком.образца [53],чтоОнаобеспечиваетпозволяетзначительносократить энергозатраты, исключить потери тепла [54, 55]. Микроволноваяэкстракция икаризида I в течение 10 мин оказалась более эффективной посравнению с традиционными методами извлечения [56]. Экспериментыпоказали, что выходы продукта экстракции возрастают с увеличениеммощности.
Оптимальными условиями микроволнового извлечения являютсямощность 600 Bт, температура 70 °С и продолжительность 10 мин. Сиспользованием микроволновой экстракции разработан метод определенияэпимедина А, В, С, икариина и икаризида I с помощью ВЭЖХ в сочетании сдиодно-матричным детектором и тандемным масс-спектрометром [56].1.3 Выделение отдельных биоактивных компонентов горянкиКомпоненты горянки и их функции изучают с помощью выделения попринципу биоактивности [57].
Для доказательства биоактивности веществаготовят «нокаут» экстракт, из которого данный компонент удалён [58]. Еслибиоактивность полученного экстракта меньше, то устранённый компонентявляется физиологически активным. Такой подход используют в геннойинженерии и фармакологических исследованиях с 1989 г.
[59]. Дляприготовления«нокаут»экстрактаиспользуютразличныевариантыхроматографии.В последнее время для выделения монокомпонентов применяютвысокоскоростную противоточную хроматографию [60-75]. Так, предложенспособизвлеченияикариина)сбиоактивныхиспользованиемкомпонентов(эпимедина А, B, Cвысокоскоростнойипротивоточнойхроматографии и препаративной ВЭЖХ для оценки антиостеопорознойактивности [43]. Для этого порошок травы горянки (Herba Epimedium)экстрагировали 3 раза 70%-ным этанолом. Экстракт сушили под вакуумом вроторном испарителе.
Высушенный порошок растворяли в подвижной фазе.17Высокоскоростнуюпротивоточнуюхроматографиюпроводилисприменением смесей н-гексан: н-бутанол: метанол: вода (1: 5: 1,5: 6,5 пообъёму). Препаративное выделение осуществляли на колонке PRC-ODSдлиной 250 мм, внутренним диаметром 20 мм, с размером зерна сорбента5 мкм (фирмы «Shimadzu»). В качестве подвижной фазы использоваливодный0,05%-ныйрастворфосфорнойкислотыиацетонитрил.Детектировали действующие вещества при 270 нм.ОписанEpimediumметодsegittatumхроматографии [46].выделениясикариинапомощьюВысушенныеизэтанольноговысокоскоростнойлистьяэкстрактапротивоточнойEpimediumsegittatumэкстрагировали 95%-ным этанолом 3 раза.
Экстракты объединяли и сушилипод вакуумом. Гидрофобные компоненты удаляли последовательнымизвлечением н-гексаном, дихлорметаном и этилацетатом. Затем остаток 3раза экстрагировали н-бутанолом. Экстракт упаривали под вакуумом исушиливымораживанием.Ввысокоскоростнойпротивоточнойхроматографии использовали систему растворителей, состоящую из смеси нгексан: н-бутанол: метанол: вода (1: 4: 2: 6 по объёму).
Авторам удалосьвыделить икариин с чистотой 85,7% и 86,2%, которую проверяли методомВЭЖХ с УФ-детектированием при 254 нм. Икариин с чистотой более 98%получали после перекристаллизации из воды.В отличие от работы [46] Ренмин Лиу и др. [45] предложили способвыделения икариина с чистотой 99,7% в одну стадию разделения. Авторамтакже удалось выделить эпимедокореанозид I (98,2%) и икаризид II (98,5%).Подготовка сырого экстракта заключалась в измельчении сухих листьевEpimedium koreamum. Полученный порошок экстрагировали 70%-нымэтанолом в течение 2 ч с обратным холодильником.
Экстракцию повторялидважды. Объединённый экстракт концентрировали под вакуумом. Болееэффективенметодпрепаративногоразделениясиспользованиемвысокоскоростной противоточной хроматографии проводили с применениемсмеси хлороформ: метанол: вода (4: 3,5: 2 по объёму). Данная система18растворителей оказалась оптимальной. При использовании смеси этилацетат:вода (5: 5 по объёму) чистота икаризида II составила только 68,2%.
Системарастворителей этилацетат: метанол: вода (5: 1: 5 и 5: 3: 5 по объёму)позволилаполучитьикариинсчистотой98%,аикаризид IIиэпимедокореанозид I ниже, чем 80%. При применении смесей хлороформ:метанол: вода (4: 2,5: 2 и 4: 3: 2 по объёму) значительно увеличилось времяразделения.Приизменениисоотношениярастворителейна4: 3: 2,наблюдалось уширение пика икаризида II, а соотношение 4: 4: 2 привело куменьшению чистоты выделяемых флавоноидов. Также исследовано влияниескорости вращения, скорости потока подвижной фазы и температуры наразделение изучаемых компонентов. Оптимальные результаты наблюдалисьпри потоке 2.0 мл/мин, частоте вращения 900 об/мин и температуре 25 °С.Чистоту выделенных флавоноидов проверяли методом ВЭЖХ с УФдетектированием при 254 нм, а структуру подтверждали 1Н и13С ЯМРспектрами.Авторам работы [76] удалось выделить четыре индивидуальныхбиоактивных флавоноида с использованием двухрежимной противоточнойхроматографии с системой растворителей, состоящей из н-бутанола:этилацетата: воды (3: 7: 10 по объёму).
Экстракцию из высушенныхнадземных частей Epimedium brevicornum Maxim. проводили этилацетатом иэтанолом при обработке ультразвуком. Чистота активных компонентовсоставляла 98,2% для эпимедина А, 92,6% для эпимедина В, 90,4% дляэпимедина С и 96,8% для икариина.Представленные способы выделения флавоноидов горянки позволяютполучать их в достаточных количествах, тем самым способствуя изучениюбиологической активности данных компонентов и контролю качествафитопрепаратов.191.4 Методы определения целевых аналитов1.4.1 Тонкослойная хроматографияТонкослойная хроматография (ТСХ) занимает одно из ведущих мест вкачественномиполуколичественноманализесложныхприродных,фармацевтических, медикобиологических и химических объектов [77, 78].Основными преимуществами ТСХ являются ее быстрота, стабильность,гибкость и низкая стоимость анализа [79, 80].
В фармацевтическойпромышленности ТСХ применяют для быстрого качественного анализа илиидентификации различных объектов [81]. Несмотря на все преимуществаТСХ данный метод для определения флавоноидов горянки применяютсравнительно редко.Авторытонкослойнуюработы [42]сравнилихроматографиюВЭЖХ(ВЭТСХ)исвысокоэффективнуюденситометрическимдетектированием икариина из пяти различных образцов сухого экстрактаEpimedium koreanum и не обнаружили в полученных двумя методамирезультатах никаких статистически значимых различий.
ВЭЖХ проводилипри комнатной температуре в течение 40 мин. В качестве подвижной фазыиспользовали ацетонитрил и 0,03%-ный водный раствор трифторуксуснойкислоты. Детектировали при 270 нм.ВЭТСХ проводилина стеклянных пластинахKieselgel 60 F 254(10 × 10 см) с использованием в качестве подвижной фазы смеси изэтилацетата: ледяной уксусной кислоты: муравьиной кислоты: воды(10: 1: 1: 2 по объёму). Время элюирования составляло 20 мин. Длявизуализации разделённых веществ использовали УФ-облучение при 270 нм.Показано, что предложенный метод можно применять для определенияикариина в экстрактах горянки.201.4.2 Капиллярный электрофорезКапиллярный электрофорез (КЭ) на сегодняшний день является однимиз наиболее перспективных и высокоэффективных методов разделения,анализа сложных смесей и находит всё более широкое применение, в томчисле для исследования лекарственных растений [82-93].
Данный методхарактеризуется экономичностью, благодаря экспрессности анализа, высокойэффективностью разделения и небольшим расходом реагентов [94, 95].КЭ применяют и для анализа флавоноидов горянки. Предложен методКЭ-УФдляодновременногоопределенияикариина,икаризида IIиэпимедина А [49]. Сухие листья экстрагировали этанолом: водой (70: 30) поддействием ультразвука, после чего пропускали через колонку HP 20(500 × 20 мм), применяя в качестве элюента 60%-ный этанол. Оптимальныеусловия КЭ были получены при использовании 8 мМ бората натрия вацетонитриле-воде (60: 40 по объёму) (рН 11,4), напряжении + 20 кВ идетектировании при 270 нм.
Минимальные определяемые содержания длятрехфлавоноидовколебалисьот0,24до0,84 мг/кг(отношениесигнал/ шум ≥ 3).Пикимиграцииидентифицировалитремяпиков неизвестныхспособами:компонентовсосравнениемвременамивременмиграциистандартных образцов, полученными в тех же условиях, сравнением УФспектров со спектрами стандартных образцов икариина, икаризида II иэпимедина А, полученными в тех же условиях, использованием методадобавок.Данные, полученные методом КЭ-УФ, подтверждали ВЭЖХ-УФ [96].Оба метода дали сопоставимые результаты (табл. 2).Таблица 2 – Содержание флавоноидов в листьях различных видов горянки, полученныеметодами КЭ-УФ и ВЭЖХ-УФ (мкг/кг) [49]№п/пОбразецИкариинИкаризид IIЭпимедин АКЭВЭЖХКЭВЭЖХКЭВЭЖХ1E. sagittatum Maxim.20,420,84,24,510,410,82E.
pubescens Maxim.32,531,09,08,718,417,621№п/пИкариинОбразецИкаризид IIЭпимедин АКЭВЭЖХКЭВЭЖХКЭВЭЖХ3E. wushanense T. S. Ying54,252,712,011,236,235,74E. acuminatum16,316,94,24,412,111,65E. koreanum Nakai74,172,820,319,655,657,16E. leptorrhizum Stearn67,566,216,216,646,846,07E. membranaceus Franch45,344,111,410,729,228,58E. fargesii Franch55,452,916,216,140,039,29E. davidii Franch28,126,46,36,016,316,210E. sutchanense Franch42,743,213,112,531,230,9Из табл. 2 следует, что содержание флавоноидов зависит от видагорянки. Это означает, что растения разных видов сильно отличаются покачественному составу и по фармакологическому эффекту.Авторы работы [97] оптимизировали метод [98] для количественногоопределения флавоноидов в горянке с использованием капиллярного зонногоэлектрофореза (КЗЭ) с диодно-матричным детектированием для контролякачества растительного сырья и медицинских препаратов на его основе.Лучшееразделениедействующихкомпонентовдостигнутоприиспользовании 50 мМ боратного буферного раствора (рН 10,0), содержащего22% ацетонитрила в качестве модификатора, напряжении 15 кВ итемпературе 25 °С (рис.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
