Определение флавоноидов горянки и их метаболитов методом тандемной хроматомасс-спектрометрии высокого разрешения (1105645), страница 9
Текст из файла (страница 9)
К 1 г измельчённого сырьядобавляли 30 мл экстрагента (50%-ный раствор этанола в воде). Смесьвыдерживали в ультразвуковой бане при 50 °С в течение 30 мин. После этогоотбирали 1 мл экстракта, центрифугировали 12 мин при 16000 об./мин,пропускали через бумажный фильтр с размером пор 0,45 мкм и исследовалихроматомасс-спектрометрически.Проводилитрипоследовательныеэтанольные экстракции.Количественный анализ полученных экстрактов осуществляли методомВЭЖХ-МС/МС в условиях, представленных в разд.
2.7.2.562.7.4 Схема эксперимента по разработке способаопределения действующих соединений горянки в биологических пробахАнализ после разбавления. К образцу мочи (5 мл) добавляли 0,05 млвнутреннего стандарта, содержащего куместрол (с концентрацией 10 мкг/мл,полученный последовательным разбавлением метиловым спиртом исходногораствора с концентрацией 1 мг/мл, приготовленный согласно разд. 2.6.5.).Затемвносили6,5 млацетонитрила,тщательноперемешивали,центрифугировали в течение 10 мин при 13400 об./мин. Отбирали 1 млнадосадочного слоя и анализировали.ЖЖЭ.
К образцу мочи (5 мл) добавляли 0,05 мл внутреннего стандарта,при проведении ферментативного гидролиза вносили 1 мл фосфатногобуферного раствора с pH 6,5, 0,03 мл раствора бета-глюкуронидазы иинкубировали в течение 80 мин при 55 °С. Затем для осуществленияэкстракции в кислой среде добавляли 0,05 мл концентрированной солянойкислоты, в щелочной среде – 1 мл карбонатного буферного раствора сpH 10,0.
После чего вносили 1 г хлорида натрия и тщательно перемешивали.Экстрагировали 5 мл органического растворителя или смесью растворителейв течение 10 мин на автоматическом экстракторе. Центрифугировали при3000 об./мин в течение 10 мин, органический экстракт упаривали досуха втоке азота при комнатной температуре. Сухой остаток перерастворяли в0,1 мл подвижной фазы B и анализировали.ТФЭ.
К образцу мочи (5 мл) добавляли 0,05 мл внутреннего стандарта.Кондиционированиесорбентапроводилипутемпоследовательногопропускания через картридж 4 мл метанола и 4 мл воды. Далее загружали5 мл образца и пропускали со скоростью 1-3 капли/с. Промывкуосуществляли 4 мл воды. Патрон сушили под вакуумом в течение 5 мин.Элюировали 4 раза по 1 мл метанола. Элюат упаривали досуха в токе азота,сухой остаток перерастворяли в 0,1 мл подвижной фазы B и анализировали.Валидацию разработанной методики проводили согласно руководствуповалидациибиоаналитическихметодов [183]иметодическим57рекомендациямГОСТ Р ИСО 5725-1-2002 [184]иГОСТ Р ИСО 5725-2-2002 [185].2.7.5 Схема эксперимента по разработке способа обнаруженияфлавоноидов горянки в растительном сырье и продуктах на его основеИсследованиепроводилинавысокоэффективномжидкостномхроматографе Dionex Ultimate 3000 RS, соединенном с масс-спектрометромOrbitrap Fusion с орбитальной ионной ловушкой высокого разрешения иисточником ионизации EASY-Max-NGTM.Масс-спектры получали в условиях ИЭР.
Напряжение на капилляресоставляло4,0 кВ;температуракапилляра270°С;температуранараспылителе 280°С; скорость потока распыляющего газа (азот) 0,40 л/мин;скорость потока вспомогательного газа (азот) 0,1 л/мин; скорость потокагаза-осушителя(азот)0,05 л/мин.Детектироваливдиапазонемасс100 - 1550 Да при регистрации положительно и отрицательно заряженныхионов с разрешением 35 000 (на половине высоты) и точностью определениямасс5 м.д.Масс-спектрыполучалидиссоциацией,индуцируемойсоударением, в ионной ловушке CID (с использованием гелия марки «6.0» вкачестве газа-реагента).Обработкуданныхпроводилисприменениемпрограммногообеспечения Xсalibur версии 3.0 (Thermo Scientific, США).При определении флавоноидов использовали колонку с обращеннофазовым сорбентом Hypersil Gold aQ, длиной 150 мм, внутренним диаметром2,1 мм, размером зерна сорбента 3 мкм, фирмы «Thermo Scientific».Температураколонкисоставляла45 °С,объёмнаяскоростьпотокаподвижной фазы – 0,6 мл/мин.
В качестве подвижной фазы использовали0,1%-ный раствор муравьиной кислоты в смеси ацетонитрил/вода всоотношении 5 : 95 (об.) (А) и 0,1 % раствор муравьиной кислоты вацетонитриле (В). Хроматографическое разделение веществ проводили врежиме градиентного элюирования: 0-1 мин — 20% В; 4 мин — 25% В;584,5 мин — 40% В;7,5 мин — 95% В;7,5-10,5 мин — 95% B;11 мин —20% B. Время анализа с учетом стабилизации системы перед вводомследующего образца составляло 15 мин.
Объём вводимой пробы – 5 мкл.2.7.6 Получение биоматериалаЭкспериментальныеисследованияпроводилисиспользованиембиологической модели белых беспородных крыс-самцов массой 200-350 г сприменением обменных камер типа «Metabolic cage for rats» (рис. 6).Рис. 6. Обменная камера типа «Metabolic cage for rats».Сбор мочи животных осуществляли с оценкой ее объема. Параллельноиспытаниям опытных крыс проводили оценку контрольных особей,получающих вместо исследуемых веществ растворитель, с использованиемкоторого готовили препарат. Контрольные образцы получали при том жепути введения в организм и в те же сроки.
Количество животных в группесоставляло5 голов.специализированныхДляисследованийпитомников(ФГУПиспользовали«Питомниккрыслабораторныхживотных «РАППОЛОВО», Санкт-Петербург), не менее двух недельсодержавшихся в карантине в виварии при свободном доступе к воде испециализированному корму типа гранулированного ПК-120 без примененияиных кормовых добавок и препаратов.59Животных маркировали и распределяли по группам. Не менее чем задва часа до начала исследований крысам опытной и контрольной группограничивали доступ к пище при сохранении свободного доступа к воде.Перед началом исследования проводили подготовку метаболическихкамер.
Предварительно вымытые с мыльным раствором, промытые затем неменее 10 раз проточной и не менее 3 раз дистиллированной водой ивысушенные при комнатной температуре детали подвергали специальнойобработке.Детали камеры, соприкасающиеся с экскрецией животных (сеткаподдона камеры, сборная воронка, мочевое кольцо, разделительный конус,кало- и мочеприемник) дополнительно обрабатывали стерильным ватнымтампоном, обильно смоченным гексаном марки х.ч. (слитую жидкостьсобирали в чистые виалы для исследования), а после высыхания – тампономс избытком раствора 96% этанола (слитую жидкость также подвергали сборуи анализу). При высыхании деталей, камеру собирали и использовали дляпроведения исследования.Введение осуществляли внутрижелудочно зондово в виде экстрактаEpimedium Brevicornum в 50% растворе полиэтиленгликоля (ПЭГ) 400 вдеионизованной воде в дозе 500 мг/кг (3 мл/кг) [186, 187].После введения препарата животных немедленно переносили вметаболическую камеру.
Им предоставляли свободный доступ к воде приисключении приема пищи.Отбор проб проводили через 0-12, 12-24, 24-36 часов после введенияпрепарата.60Глава 3. Результаты и обсуждение3.1 Разработка способа определения флавоноидов горянки методомВЭЖХ-МС/МСПоскольку горянка используется в фитомедицине во всем мире, быловыполнено большое число работ с целью разработки аналитических методовидентификации,количественногоопределенияиконтролякачестварастительного сырья, экстрактов и коммерческих продуктов на их основе, вразд.
1.4 приведена информация по некоторым из них. В последние 20 летнаиболеепопулярнымиметодамиопределенияфлавоноидовданныхрастений стали различные варианты МС детектирования. При этомрегистрация в режиме выбранных ионных переходов обладает хорошейчувствительностью и лучшими метрологическими характеристиками. ОднакодляразработкинеобходимометодикналичиеоптимизироватьсСО,условияиспользованиемтаккакнарегистрациипредложенногопервомэтапемасс-спектровспособанеобходимодлякаждогоисследуемого соединения. Но при проведении первоначального скринингарастительного сырья и обнаружении минорных флавоноидов использованиеСОявляетсянецелесообразнымвсилуихвысокойстоимостиитруднодоступности. В этом случае оптимальной является групповаяидентификацияфлавоноидовгорянкипомасс-спектральнымихроматографическим характеристикам.
Для этого необходимо изучениеособенностейформированиямасс-спектров основных компонентов сприменением ВЭЖХ-МС/МС высокого разрешения.3.1.1 Разработка способа идентификации икариинаМасс-спектрометрическиеизучалинапримереСОхарактеристикиикариинапутёмфрагментации по масс-спектрам второго порядка.флавоноидоввыявлениягорянкиособенностей61В нашей работе мы использовали ИЭР молекул аналитов и ХИАД,используемую, как правило, для слабополярных, трудноионизируемыхсоединений. Для сравнения на рис.
7 приведены масс-спектры раствораикариина с концентрацией 10 мкг/мл, полученные нами при ХИАД и приИЭР. Из-за более высокой интенсивности сигналов в области молекулярногоиона и высокого отношения сигнала к шуму, выбрали ИЭР.Рис. 7. Масс-спектры пика, соотьветствующего икариину с концентрацией10 мкг/мл в метаноле, в режиме регистрации положительно заряженных ионов приХИАД (а) и при ИЭР (б).По литературным данным известно, что при использовании ИЭРикариин детектируется в условиях регистрации положительно [133] иотрицательнозаряженныхионов [137].Поэтомунапервомэтапеисследование детектирование осуществляли при двух режимах ионизации с62применением масс-спектрометрии высокого разрешения. Это позволилоопределить точные массы ионов, соответствующие моноизотопным массампротонированных молекул икариина.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
