Определение флавоноидов горянки и их метаболитов методом тандемной хроматомасс-спектрометрии высокого разрешения (1105645), страница 11
Текст из файла (страница 11)
В качестве элюентов были выбраны0,1%-ный раствор муравьиной кислоты в смеси ацетонитрил/вода всоотношении 5 : 95 (об.) (элюент А) и 0,1% раствор муравьиной кислоты вацетонитриле(элюент В).соответствующимчувствительностьИспользованиеслабокисломуподвижныхраствору,масс-спектрометрическогофазпозволилодетектированиясpH,повыситьзасчётувеличения доли заряженной формы определяемых веществ в электроспрее.В качестве неподвижной фазы, используемой для хроматографическогоразделения, применяли сорбент на основе силикагеля, модифицированныйгруппами С18 (Hypersil Gold aQ) с полярными функциональными группами,обеспечивающимидополнительныймеханизмвзаимодействиядляразделения полярных соединений. Применяли четыре колонки, заполненныеданным сорбентом, размерами 150×2,1 мм (диаметром зерна сорбента1,9 мкм и 3 мкм), 100×2,1 мм (1,9 и 3 мкм).
Также на данном этапе работыпараллельнодостиженияварьировалипрограммумаксимальныхградиентногочувствительности,элюированиядляэффективностииоптимального коэффициента емкости (от 1 до 5). Приемлемых времёнудерживания определяемых веществ и их полного разделения удалосьдостигнуть при использовании колонки 150×2,1 мм с диаметром зернасорбента 3 мкм и программой градиентного элюирования, представленной нарис. 16. При этом, чем больше в структуре соединений гликозидныхостатков, тем меньше у них время выхода.73100Элюент В, %806040200051015Время, минРис.
16. Программа градиентного элюирования.На рис. 17 представлены хроматограммы стандартного раствора,содержащего 6 флавоноидов (рис. 17а), и растительного экстракта (рис. 17б).Параметры хроматографического разделения аналитов приведены втабл. 12 (при расчётах использовали величину мёртвого времени, равного0,7 мин).Таблица 12 – Параметры хроматографического разделения икариина, икаритина,эпимединов A, B и икаризидов I, II на колонке Hypersil Gold aQ (150 × 2,1 мм, размерзерна сорбента 3 мкм) при скорости потока 0,6 мл/минКоэффициентВеществоВремя удерживания, минРазрешение пиковЭпимедин А3,671,61,1Эпимедин В3,932,11,1Икариин4,4110,91,4Икаризид I5,874,51,1Икаризид II6,016,21,2Икаритин6,99--селективности74Рис.
17. Хроматограммы в режиме сканирования по выбранным ионным переходам: а –стандартного раствора, содержащего 0,1 мкг/мл икариина, икаритина, эпимединов A, B иикаризидов I, II; б - этанольного экстракта из настойки на основе корейской горянки(Epimedium koreanum).75Апробация на реальных объектах. Для апробации разработанногоспособа определения флавоноидов были проанализированы 3 препарата наоснове горянки.1.
Экстракт горянки коротконожковой (Epimedium brevicornum) –порошок горчичного цвета (Прикладная биотехнология, Россия).2. Гранулированный чай с экстрактом горянки корейской (Epimediumkoreanum) – представляет собой измельченные сухие листья, расфасованныев фильтр-пакеты (Государственная Корпорация Здравоохранения «Маннён»,Северная Корея).3. Настойка из горянки корейской, представляющая собой вязкуюжидкостьтёмко-коричневогоцвета(ГосударственнаяКорпорацияЗдравоохранения «Маннён», Северная Корея).Экстракцию проводили 70%-ным раствором этанола в воде (согласноразд. 2.7.2).
В качестве примера, на рис. 17б приведена хроматограмма врежиме сканирования по выбранным ионным переходам этанольногоэкстрактаизнастойкинаосновекорейскойгорянки.Содержаниефлавоноидов в исследованных образцах приведено в табл. 13. Расчётсодержанийаналитовградуировочнойпроводилизависимостисогласно(табл. 14)спостроеннымуравнениямиспользованиемрастворов,приготовленных согласно разд. 2.6.6.Предложенный нами способ определения флавоноидов горянкиметодом ВЭЖХ-MC/MC отличается хорошей селективностью по отношениюк основным компонентам горянки, и низкими пределами обнаружения посравнению с используемыми ранее методами [37, 38].
В результатепроведённых исследований удалось сократить время хроматографическогоанализа с 40 [56] до 15 мин. Данный способ обладает широким диапазономлинейностиградуировочногографикаиможетприменятьсядляколичественного анализа как растительных экстрактов, так и фитопродуктови лекарственных средств на основе горянки, а также для контроля качествакоммерческих продуктов.76Таблица 13 – Содержания флавоноидов, определённые в режиме сканирования повыбранным ионным переходам, в образцах экстракта Epimedium brevicornum, чая сэкстрактом Epimedium koreanum и настойки из Epimedium koreanum (N=3, P=0,95)Содержание, мг/г№п/пОбразец1ЭкстрактEpimediumbrevicornum2Чай сEpimediumkoreanum3НастойкаизEpimediumkoreanumЭпимединАЭпимединВИкариинИкаризид IИкаризид IIИкаритин28±240±4153±102,6±0,331±31,0±0,1(12,1±0,6)(16,6±0,2)(7,0±0,6)(1,2±0,1)(2,3±0,2)(6,2±0,2)×10×10×10×10×10×10-4-22,7±0,2-23,6±0.5-110,1±0,2-2-2(1,1±0,1)(6,8±0,8)(11,8±0,8)×10×10×10-3-1-1Таблица 14 – Метрологические характеристики разработанной методики определенияфлавоноидов горянки методом ВЭЖХ-МСВеществоДиапазонлинейностиградуировочногографика, мкг/млУравнениеградуировочнойзависимостиSr, %Пределобнаруженияв водномрастворе,мкг/млЭпимедин А0,001-25y=2,2×104x+2,7×10690,0005Эпимедин В0,001-25y=2,1×104x+3,0×10680,0005Икариин0,002-25y=4,4×104x+9,2×106100,0007Икаризид I0,001-10y=5,1×104x+1,9×107110,0005Икаризид II0,001-10y=6,3×104x+4,7×107120,0005Икаритин0,003-25y=1,0×105x+2,0×107100,0009На основании полученных результатов разработана, аттестована ивнесена в реестр аттестованных методик измерения Федерального агентствапо техническому регулированию и метрологии «Росстандарт» методикаизмерений содержания икариина, икаритина, икаризида I, икаризида II,эпимедина А, эпимедина В и эпимедина С в биологически активных77добавках методом высокоэффективной жидкостной хроматографии сприменением тандемной масс-спектрометрии под №6.00163/2-28-2016 от28.03.16 (Приложение Б), что подтверждается свидетельством об аттестации,приведённом на рис.
А1 Приложения. Предложенный способ определенияфлавоноидовгорянкииспользуетсявФГУП«НЦ«Сигнал»,чтоподтверждается актом внедрения, приведённым на рис. А2 Приложения.3.2 Разработка способа группового обнаружения флавоноидовгорянкиИдентификация основных компонентов горянки и поиск их новыхпроизводных в растительном сырье являются важными задачами. Многиеметоды идентификации и установления структуры соединений в сложныхмногокомпонентных матрицах основываются на индивидуальном выделениикомпонента и анализе его с помощью ЯМР-спектрометрии [189-201],позволяющей установить структуру аналитов по совокупности 1Н и13С-спектров.
Такой процесс в отличие от метода ВЭЖХ в сочетании с массспектрометрией высокого разрешения трудоемок и длителен, так как требуетпредварительного препаративного разделения компонентов по фракциям иконцентрирования исследуемых соединений при малом их содержании вэкстракте.Для идентификации флавоноидов горянки в матрице растительногоэкстракта методом тандемной масс-спектрометрии высокого разрешениянеобходимо детальное изучение фрагментации данных соединений, а такжеопределениехарактеристичныхподтверждатьпринадлежностьфрагментныхнеизвестныхионов,соединенийпозволяющихкклассуфлавоноидов горянки при отсутствии полного комплекта стандартныхобразцов.
Данный метод позволяет получать значения масс анализируемыхвеществ с точностью до 5 м.д., что делает обнаружение целевых аналитовболее селективным [202].78Современный тандемный масс-спектрометр позволяет исследоватьструктурные особенности на основании масс-спектров, получаемых за счётразличныхтиповфрагментации,безпредварительноговыделенияиндивидуальных соединений. Одним из используемых типов фрагментацииявляется CID («collision induced dissociation» - «диссоциация, индуцируемаясоударениями») в ионной ловушке при заданной варьируемой энергиистолкновений.На начальном этапе работы (разд. 3.1.1-3.1.2) получены масс-спектрывысокого разрешения для имеющихся в наличии стандартов: икариина,икаритина,икаризидов I, II,эпимединов А, В.В режимерегистрацииотрицательно заряженных ионов образуются депротонированные молекулыаддукта икариина, икаризида I, эпимединов А, В с муравьиной кислотой(компонентом подвижной фазы) [M+HCOOH–H]– и депротонированныемолекулы [M–H]– икаритина и икаризида II.
Масс-спектры первого порядкаимеющихся стандартов в условиях регистрации положительно заряженныхионовсодержатинтенсивныйион[M+H]+.Согласнорезультатампредварительных экспериментов, в режиме регистрации положительнозаряженных ионов чувствительноcть определения соединений выше, а массспектры –интенсивнее, чем в режиме регистрации отрицательно заряженныхионов. Поэтому в дальнейшей работе использовали только первый изуказанных режимов.Следующий этап заключался в получении МСn-спектров (где n = 2 - 4)ивыявленииособенностейфрагментацииикариина,икаритина,икаризидов I, II, эпимединов А, В. Условия хроматографического разделенияи масс-спектрометрического детектирования представлены в разд.
2.7.2.Исследованияпроводилиспомощьюдиссоциации,индуцируемойсоударением. Фрагментация с использованием данного режима в настоящеевремя является наиболее широко используемой в тандемной массспектрометрии. Ионная диссоциация протонированных молекул происходитв линейной ионной ловушке благодаря столкновению с молекулами79инертного газа – гелия [203].
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
