Определение флавоноидов горянки и их метаболитов методом тандемной хроматомасс-спектрометрии высокого разрешения (1105645), страница 14
Текст из файла (страница 14)
28) в моче крыс удалось обнаружить несколькосоединений,отсутствующихвэкстрактегорянкикоротконожковой(Epimedium brevicornum) и в бланковых образцах мочи, предположительнопринадлежащих к метаболитам (M1-6). Для установления возможнойструктуры метаболитов были изучены МСn-спектры данных соединений.Рис. 28. Хроматограмма в режиме сканирования по выбранным ионным переходаммочи крыс через 12 часов после приёма экстракта горянки.ВМС3-спектреприсутствовалионсоединениясМ1m/z 313,0707,современемуказывающийвыходана4,8 минвозможнуюпринадлежность к флавоноидам горянки (рис. 29В). Ион с m/z 367,1175отличается от характеристичного для флавоноидов фрагментного иона369,1333 на 2,0158 Да, что говорит о наличии двойной связи, возможно,вследствие отщепления гидроксильной группы в изопентеновой цепи(рис.
29Г). Фрагментный ион с m/z 547,1812 в MC2-спектре отличается от ионас m/z 385,1280 в MC3-спектре на 162,0528 Да, что соответствует отщеплениюглюкозного остатка, вероятно, в положении С7, так как именно при этомуглеродном атоме связь с углеводной группой более стабильна, чем при С3.102Ион-продукт с m/z 693,2392 в масс-спектре первого порядка отличаетсяот иона с m/z 547,1812 в MC2-спектре на массу рамнозного остатка(146,0579 Да), что указывает на данный заместитель в структуре исследуемогокомпонента, возможно, в положении С3.
Интенсивный ион с m/z 693,2392 вМС-спектре, вероятно, соответствует протонированной молекуле [M+H]+(рис. 29Б), а ион с m/z 737,2293 в режиме регистрации отрицательнозаряженных ионов - депротонированной молекуле аддукта с муравьинойкислотой (рис. 29A).Полученные данные были сопоставлены с результатами программногообеспеченияACDLabs/biotransformation(версии 14.0),mapsACDLabs/Percepta, указывающими на гидроксилирование в положении С14или С15 как возможный путь метаболизма.
Таким образом, вероятнаяструктура метаболита М1 представлена на рис. 29Д. С применениемпрограммыметаболомногоанализаполученныххромато-масс-спектрометрических данных MetWorks версии 1.3 фирмы «Thermo Scientific» вэкстрактах проб было подтверждено наличие данного метаболита.Согласнопроведённымисследованиям,алгоритминтерпретацииданных, полученных методом ВЭЖХ-МСn в режиме зависимого сканированияионов-продуктов с предварительно установленными значениями нейтральныхпотерь (132,0423, 146,0579 и 162,0528 Да) состоит в следующем:1. Поиск в спектрах m/z характеристичных фрагментных ионовфлавоноидов горянки (m/z 369,1333 (367,1176) и 313,0707).2.
Установление структуры соединения на основании характернойфрагментации (последовательное отщепление углеводных заместителей:сначала происходит потеря групп в положении С3, затем в положении С7).3. Сравнение экспериментальных значений m/z с теоретическими(расхождение не более 5 м.д.).4. Сопоставление полученных данных с результатами программногообеспеченияACDLabs/ biotransformationACDLabs/Percepta, MetWork (версии 1.3).maps(версии14.0),103Рис. 29. Хроматограмма пробы мочи: по выделенному иону с m/z 737,2293 в режиме регистрации отрицательно заряженных ионов(А), по выделенному иону с m/z 693,2392 в режиме регистрации положительно заряженных ионов (Б); MCn-спектры соединения современем выхода 4,81 мин (В); предположительная структура фрагментного иона с m/z 367,1175 (Г); возможная структура метаболитаМ1 (Д)104Используя данный алгоритм, были обнаружены метаболиты М2-М6(рис.
А3-А7 Приложения), вероятные структуры которых приведены втабл. 20, а характеристичные фрагментные ионы в МСn-спектрах в табл. 21.Таблица 20 – Предположительные структуры метаболитов флавоноидов горянкиМетаболитR1R2R3M1glurhaОНM2gluHОНM3HrhaОНM4glurha-(1-2)gluОНM5glurha-(1-2)xylОНM6glurha-(1-2)rhaОНПримечание: rha – рамнозил, glu – глюкозил, xyl - ксилозилR4HHHHHHМоноизотопнаямасса, Да692,2316546,1737530,1788854,2845824,2739838,2895Таким образом, разработанный алгоритм позволяет выявлять основныекомпоненты горянки и их метаболиты и может использоваться дляисследований фармакокинетических параметров.Таблица 21 – Характеристичные фрагментные ионы метаболитов горянки в МСn-спектрах, полученных в условиях диссоциации,индуцируемой соударениемСоединениеMCMC2MC3MC4105[693,2392]:[547,1812]:547,1812 (100) [M-rha]+,385,1280 (100) [M-glu]+,M1385,1280 (50)367,1175 (50),313,0707 (35)547,1815 (100) [547,1815]:[M+H]+385,1280 (100) [M-glu]+,M2367,1175 (50),313,0707 (35)531,1857 (100) [531,1857]:[M+H]+385,1280 (100) [M-rha]+,M3367,1175 (50),313,0707 (35)855,2910 (100) [855,2910]:[855,2910→693,2390]:[855,2910→693,2390→547,1812]:+++[M+H]693,2390 (100) [M-glu] ,547,1812 (100) [M-glu-rha] ,385,1280 (100) [M-2glu-rha]+,M4547,1815 (60)385,1280 (50)367,1175 (50),313,0707 (35)825,2820 (100) [825,2820]:[825,2820→693,2390]:[825,2820→693,2390→547,1812]:[M+H]+693,2390 (100) [M-xyl]+,547,1812 (100) [M-glu-xyl]+,385,1280 (100) [M-2glu-xyl]+,M5547,1815 (60)385,1280 (50)367,1175 (50),313,0707 (35)839,2975 (100) [839,2975]:[839,2975→693,2390]:[839,2975→693,2390→547,1812]:[M+H]+693,2390 (100) [M-rha]+,547,1812 (100) [M-glu-rha]+,385,1280 (100) [M-2glu-rha]+,M6547,1815 (60)385,1280 (50)367,1175 (50),313,0707 (35)Примечание: glu = глюкозил, rha = рамнозил, xyl = ксилозил.[ион-предшественник]: m/z (Iотн, %)693.2392 (100)[M+H]+106ВЫВОДЫ1.
Изучены закономерности формирования масс-спектров флавоноидовгорянки методом тандемной масс-спектрометрии высокого разрешения.Ключевыми этапами фрагментации являются: потеря групп в положении С3;затем в положении С7 с образованием иона-продукта с m/z 369,1333;перегруппировка изопентеновой группы в положении С8, приводящая кпоявлению иона-продукта с m/z 313,0707.
Ионы с m/z 369,1333 и 313,0707соответствуют характеристичным сигналам, используемым при обнаружениинеизвестных флавоноидов горянки. Предложены возможные структурыфрагментных ионов.2. Разработанспособизвлеченияфлавоноидовгорянкисверхкритическим диоксидом углерода. При температуре 50 °С, давлении30 МПа и продолжительности 30 мин достигается максимальный выходцелевых компонентов, в 2,5 раза превышающий количество соединений,извлекаемых жидкостной экстракцией этанолом в ультразвуковом поле.3. Разработаныусловияхроматомасс-спектрометрическогоопределения икариина, икаритина, икаризидов I, II, эпимединов А, В, С врастительном сырье и продуктах на его основе в условиях обращеннофазовойградиентнойВЭЖХвсочетаниистандемныммасс-спектрометрическим детектированием. Для каждого соединения установленыоптимальные значения энергии соударений и определены интенсивныехарактеристичные ионы-продукты.4.
Разработаналгоритмобнаруженияфлавоноидовгорянкинаосновании закономерностей фрагментации, заключающийся в получениитандемныхмасс-спектровпредварительно(m/z 132,0423,врежимеустановленными146,0579изависимогозначениями162,0528,сканированиянейтральныхсоответствующихксилозного, рамнозного и глюкозного остатков, соответственно).спотерьотщеплению1075. Выбрана процедура подготовки образцов мочи к ВЭЖХ-МС/МСанализу, включающая сорбционное концентрирование на картриджах,заполненныхмодифицированнымполимеромстирола,элюированиеметанолом и концентрирование элюата в токе азота с последующимперерастворением сухого остатка в подвижной фазе, при этом коэффициентизвлечения составляет 93-98%, а матричный фактор, характеризующийвлияние матрицы, − 0,94-0,98.6. Разработанныйалгоритмапробированприобнаруженииметаболитов флавоноидов горянки в моче крыс.
Выявлены ранее неизвестныеметаболитыипредложеныихсоответствующие продуктам гидроксилирования.возможныеструктуры,108СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ1. Xu Z., Feng S., Shen S., Wang H., Yuan M., Liu J., Huang Y., Ding C.The antioxidant activities effect of neutral and acidic polysaccharides fromEpimedium acuminatum Franch. on Caenorhabditis elegans // CarbohydratePolymers. 2016. V. 144. P. 122–133.2.
Li H.-F., Guan X.-Y., Yang W.-Z., Liu K.-D., Ye M., Sun C., Lu S.,Guo D.-A. Antioxidant flavonoids from Epimedium wushanense // Fitoterapia.2012. V. 83. № 1. P. 44–48.3. Jiang J., Zhao B.-J., Song J., Jia X.-B. Pharmacology and ClinicalApplication of Plants in Epimedium L. // Chinese Herbal Medicines.
V. 8. № 1.P. 12–23.4. Флора CCCР. T. 7. М.:AH CCCP. 1937. С. 542–544.5. Энциклопедический словарь Ф. А. Брокгауза и И. А. Ефрона:Бесцветник. Санкт-Петербург. 1980. С. 1890–1907.6. Xu H.-B., Huang Z.-Q. Icariin enhances endothelial nitric-oxide synthaseexpression on human endothelial cells in vitro // Vascular Pharmacology. 2007.V. 47. № 1. P. 18–24.7.
Shen P., Guo B.L., Gong Y., Hong D.Y., Hong Y., Yong E.L. Taxonomic,genetic, chemical and estrogenic characteristics of Epimedium species //Phytochemistry. 2007. V. 68. № 10. P. 1448–1458.8. Pan Y., Kong L.-D., Li Y.-C., Xia X., Kung H.-F., Jiang F.-X. Icariinfrom Epimedium brevicornum attenuates chronic mild stress-induced behavioraland neuroendocrinological alterations in male Wistar rats // Pharmacol. Biochem.Behav.
2007. V. 87. № 1. P. 130–140.9. Liu B., Xu C., Wu X., Liu F., Du Y., Sun J., Tao J., Dong J. Icariin exertsan antidepressant effect in an unpredictable chronic mild stress model ofdepression in rats and is associated with the regulation of hippocampalneuroinflammation // Neuroscience. V. 294. P. 193–205.10910. Li F., Gong Q.-H., Wu Q., Lu Y.-F., Shi J.-S. Icariin isolated fromEpimedium brevicornum Maxim attenuates learning and memory deficits inducedby d-galactose in rats // Pharmacol. Biochem. Behav. 2010. V.
96. № 3.P. 301-305.11. Wu Y., Li Y., Liu C., Li E., Gao Z., Liu C., Gu W., Huang Y., Liu J.,Wang D., Hu Y. Structural characterization of an acidic Epimedium polysaccharideand its immune-enhancement activity // Carbohydrate Polymers. V. 138.P. 134-142.12. Cheng H., Feng S., Shen S., Zhang L., Yang R., Zhou Y., Ding C.Extraction, antioxidant and antimicrobial activities of Epimedium acuminatumFranch. polysaccharide // Carbohydrate Polymers. V. 96. № 1. P.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
