Определение флавоноидов горянки и их метаболитов методом тандемной хроматомасс-спектрометрии высокого разрешения (1105645), страница 10
Текст из файла (страница 10)
В режиме регистрации положительнозаряженных ионов икариин образует протонированную молекулу [M+H]+ сm/z 677,2433 с двумя изотопными пиками с m/z 678,2469 и 679,2496 (рис. 8а).Ион аддукта с m/z 699,2248, C33H40NaO15 и фрагментный ион 369,1398,C21H21O6 соответствуют присоединению натрия и отщеплению остатковглюкозы и рамнозы, соответственно. В условиях ИЭР с регистрациейотрицательно заряженных ионов образуется ион [M-H]- с m/z 675,2288 сизотопными пиками с m/z 676,2314 и 677,2344 (рис. 8б).Рис. 8. Масс-спектры пика, соответствующего икариину, в условиях регистрацииположительно (а) и отрицательно (б) заряженных ионов (Glc – глюкоза, Rha – рамноза).63В масс-спектре икариина при использовании ИЭРв режимерегистрации положительно заряженных ионов максимальную интенсивностьимеет ион с m/z 677,2433, а отрицательно заряженных ионов - с m/z 675,2288.Изучение диссоциации ионов-предшественников в тандемной массспектрометрии является необходимым этапом работы, так как без этогоневозможенпоискиправильныйвыборхарактеристичныхионов,используемых при регистрации селективных реакций для идентификациицелевых соединений в режиме MC/MC.Полученные на первом этапе исследования ионы с максимальнойинтенсивностью использовали в качестве ионов-предшественников.
СпектрыMС/MС получали варьируя энергии соударительной диссоциации вдиапазоне 10-70 В c шагом в 10 В (табл. 10).Таблица 10 – MС/MС-спектры икариина, полученные в режимах регистрацииположительно и отрицательно заряженных ионовm/z (Iотн, %)Энергиястолкновений, BРежим регистрацииположительно заряженныхионовРежим регистрацииотрицательно заряженных ионов10369,1330 (100)675,2288 (100)20369,1330 (100)675,2288 (100), 367,1185 (60)30369,1330 (100), 313,0703 (25)40369,1330 (35), 313,0703 (100)50313,0703 (100)60313,0703 (100), 243,0649 (8),187,0752 (6), 135,0440 (10),97,0288 (14)70313,0703 (100), 243,0649 (34),187,0752 (46),135,0440 (76),97,0288 (42)675,2288 (30), 367,1185 (100)367,1185 (90), 352,0952 (100),323,0925 (36)367,1185 (20), 352,0952 (100),323,0925 (80)352,0952 (80), 323,0925 (100),308,0328 (34), 295,0973 (28),281,0456 (34), 267,0298 (44),255,0298 (18)352,0952 (20), 323,0925 (94),308,0328 (36), 295,0973 (48),281,0456 (98), 267,0298 (100),255,0298 (38)Дляподтвержденияфрагментныхионовструктурыэкспериментальныеирассмотрениярезультатывозможныхсопоставлялисрасчётными, полученными с помощью программы HighChem Mass Frontierверсии 7.0.
Наиболее вероятными из представленных структур являются64фрагментные ионы с наименьшей энергией образования [188], которуювычислялиспомощьюполуэмпирическогоквантово-химическогометода AM1 при использовании программы HyperChem версии 7. Данныйметод является одним из наиболее точных и используется для большихорганических молекул, содержащих ароматические кольца и кислород.Результаты представлены в табл.
А1. Расчётные и экспериментальныезначения m/z отличаются менее чем на 5 м.д.Для определения оптимальных параметров при идентификацииикариина выбрали характеристичные фрагментные ионы с максимальнойинтенсивностью в MC/MC-спектрах и построили кривые зависимостейплощадей пиков ионов от энергии фрагментации как в условиях регистрацииположительно (рис. 9а), так и отрицательно заряженных ионов (рис.
9б).Согласно представленным кривым, максимальные площади пиков ионов сm/z 313,0703 и 369,1330 в условиях регистрации положительно заряженныхионов и с m/z 352,0952, 367,1185, 323,0925 в условиях регистрацииотрицательно заряженных ионов достигаются при 40 B.Рис. 9. Кривые оптимизации энергии фрагментации: а – в режиме регистрацииположительно заряженных ионов: 1 – 677 → 369; 2 – 677 → 313; б – в режимерегистрации отрицательно заряженных ионов: 1 - 675 → 367; 2 – 675 → 352;3 – 675 → 323; 4 –675 → 267.65Такимобразом,следующиеусловияипараметрыявляютсяоптимальными при идентификации икариина:в режиме регистрации положительно заряженных ионов – ионныйпереход с m/z 677,2433 → 313,0703, 369,1330, энергия соударений – 40 В(рис.
10а);в режиме регистрации отрицательно заряженных ионов – ионныйпереход с m/z 675,2288 → 352,0952, 367,1185, 323,0925, энергия соударений –40 В (рис. 10б).Рис. 10. МС/MC-спектры пика, соответствующего икариину, в режиме регистрацииположительно (а) и отрицательно (б) заряженных ионов при энергиифрагментации – 40 В.663.1.2 Разработка способа количественного определенияфлавоноидов горянки в режиме регистрации выбранных ионныхпереходовВыбор условий масс-спектрометрического детектирования. Как быловыяснено ранее (разд.
3.1.1) флавоноиды горянки при ИЭР образуютпротонированные и депротонированные молекулы, однако интенсивностьпервых выше, что можно наблюдать на рис. 11, где для сравненияпредставлены масс-спектры икаризида II, полученные при двух режимахионизации.Рис. 11. Масс-спектры пика, соответствующего икаризиду II в метаноле сконцентрацией 10 мкг/мл, в условиях регистрации положительно (а) иотрицательно (б) заряженных ионов.67Поэтому необходиморассмотреть целесообразность применениярежима регистрации положительно заряженных ионов на примере другихфлавоноидов, приведённых в табл. 9. В полученных масс-спектрах данныхвеществ присутствовали сигналы, соответствующие протонированныммолекулам с m/z 369,1333 для икаритина, 531,1861 для икаризида I, 515,1912для икаризида II, 839,2968 для эпимедина A и 809,2863 для эпимедина В, чтопроиллюстрировано на рис.
12 и 13.Рис. 12. Масс-спектры в условиях регистрации положительно заряженных ионовпиков, соответствующих икаритину (а) и икаризиду I (б) в метаноле сконцентрацией 10 мкг/мл.68Рис. 13. Масс-спектры в условиях регистрации положительно заряженных ионовпиков, соответствующих эпимедину А(а), эпимедину В (б) и икаризиду II (в) вметаноле с концентрацией 10 мкг/мл.69Данные ионы могут быть успешно использованы в качествепредшественников для определения аналитов в режиме мониторингазаданных реакций.На стадии оптимизации условий тандемного масс-спектрометрическогодетектирования проводили выбор оптимальных пар ионных переходов иэнергий соударений.
Для этого исследовали влияние энергии фрагментации вкамере соударений масс-спектрометра на характер спектра фрагментныхионов, образующихся при распаде протонированных молекулярных ионовопределяемых флавоноидов, и на интенсивность образующихся ионовпродуктов.Таким образом, для получения максимального аналитического сигналадля определяемых флавоноидов в режиме регистрации положительнозаряженных ионов необходимо использовать параметры работы массспектрометра, приведённые в табл. 11.Таблица 11 – Оптимизированные параметры масс-спектрометрического детектированияопределяемых флавоноидов в режиме регистрации положительно заряженных ионовЭнергиястолкновений, ВФрагментныеионы, Да(отн.
интенсивность, %)БруттоформулыионовпродуктовОпределяемое веществоИонпредшественник [M+H]+, ДаБрутто-формулаионапредшественникаЭпимедин А839,2968C39H51O2030369,1333 (100)313,0707 (15)C21H21O6C17H13O6Эпимедин В809,2863C38H49O1930369,1333 (100)313,0707 (15)C21H21O6C17H13O6Икаризид I531,1861C27H31O1140369,1333 (55)313,0707 (100)C21H21O6C17H13O6Икаризид II515,1912C27H31O1040369,1333 (55)313,0707 (100)C21H21O6C17H13O6Икариин677,2440C33H41O1540369,1333 (35)313,0707 (100)C21H21O6C17H13O6Икаритин369,1333C21H21O650313,0707 (100)243,0652 (15)C17H13O6C14H11O4Из данных табл.
11 видно, что для всех исследуемых компонентовнаблюдаетсяопределённоесходствопутейфрагментациивячейке70соударений (рис. 10а, 14, 15). Рассчитанные на основании точной массыбрутто-формулыионов-продуктовсоответствуютпредполагаемымструктурам фрагментных ионов, представленных нами ранее (разд. 3.1.1).Ионы-продукты с m/z 531,1861 и 369,1333 образуются в результатепоследовательной потери углеводных остатков. Можно предположить, чтоперегруппировка изопентеновой группы в положении 8 в А-кольце приводитк образованию фрагментного иона с m/z 313,0707 (табл. А1).
Кроме того,разрыв связи углерод метильной группы – кислород в положении 4´ иперегруппировка B-кольца c отрывом СО приводит к образованию иона сm/z 243,0652 (разд. 3.1.1).Рис. 14. МС/MC-спектры пиков, соответствующих эпимедину А (а) и эпимедину В (б),в режиме регистрации положительно заряженных ионов при энергии фрагментации - 30 В.71Рис. 15. МС/MC-спектры пиков, соответствующим икаризиду I (а), икаризиду II (б) иикаритину (в), в режиме регистрации положительно заряженных ионов при энергиифрагментации – 40 В, 40 В и 50 В, соответственно.72Выбор условий хроматографического определения. Тандемное МСдетектирование позволяет обойтись без полного хроматографическогоразделения всех исследуемых компонентов, однако использование такогоприводиткповышениюдостоверностиобнаруженияаналитов.Хроматографическое разделение осуществляли в режиме обращеннофазового градиентного элюирования.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
