Ингибирование теломеразы человека (1105569), страница 9
Текст из файла (страница 9)
Этотбелок отвечает за репликацию плазмиды, содержащий ориджин репликации68вируса SV-40 [157]. Вектор pcDNA6/myc-His C имеет SV40-ориджинрепликации. За счет этого плазмида, содержащая hTERT, реплицируются вклетке. Однако в векторе pBluescript II, несущем ген hTR, такой ориджинотсутствует. Основным недостатком SV-40 конструкций является конкуренциярепликации с транскрипцией. SV-40 антиген, избыточно связываясь сплазмидой, уменьшает экспрессию, существуют работы в которых показано,что SV-40 уменьшает экспрессию белка [158]. Для экспрессии теломеразы мырешили использовать клетки HEK293Е, содержащие антиген вируса EBV(Ebstein Baar virus) под названием EBNA-1. Ориджин репликации этого вирусаработает синхронно с делением клетки, поэтому репликация плазмиды неконкурирует с его транскрипцией [159]. Размер ориджина EBV большой(~2000п.о.), он содержит два основных элемента FR и DS (diad symmetry) [160].Известно, что чем меньше размер плазмиды, тем больше ее можнотрансфицировать в клетки и тем устойчивее будет система плазмида-клетка[161].
Есть данные о том, что DS (200п.о.) элемент достаточен для репликацииплазмиды [162]. Мы поместили DS элемент между сайтами KpnI и SalIплазмиды pBSK-U1-hTR-U2/U5, содержащей кДНК hTR под U1 промотором ис 3’-U1 терминатором (любезно предоставлена Ли Шанг). Полученнаяплазмида названа pBSK-DS-U1-hTR. Также мы поместили DS элемент в SalIсайт плазмиды p-SFFV-hTERT несущей кДНК hTERT под промотором SFFV(содержится в spleen focus-forming вирусе).
Известно, что промотор SFFVэффективно работает в различных видах тканей [163]. Полученная конструкцияназвана p-DS-SFFV-hTERT. В результате экспрессии конструкций pBSK-DSU1-hTR и p-DS-SFFV-hTERT активность теломеразы увеличилась в 3-4 раза(рис. 30). В качестве контроля плазмиды трансфецировали в другую сублиниюклеток 293Т, не имеющих EBNA-1 белка.
Видно, что DS элемент не работает вэтих клетках. Направление вставки DS элемента в плазмиде p-DS-SFFV-hTERT69не влияет на экспрессию теломеразы, т.к. DS элемент симметричен. Отсюдаследует, что при использовании репликации плазмиды экспрессия теломеразывыше, чем при использовании ингибитора деацетилаз.Для проверки синергичности двухподходов, трансфецированныеплазмидами pBSK-DS-U1-hTR и p-DS-SFFV-hTERT клетки HEK293E былиобработаны вальпроевой кислотой. Использование одновременно вальпроевойкислоты и репликации плазмид pBSK-DS-U1-hTR и p-DS-SFFV-hTERT не далосущественного увеличения экпрессии по сравнению с применением двухподходов по отдельности.
Учитывая вышеприведенные данные, мы остановиливыбор на использовании эписомальной репликации плазмиды в качествеспособа увеличения рекомбинантной экспрессии теломеразы.Рис. 30. Экспрессия теломеразы в сублиниях клеток HEK293: HEK293E –отмечены пустыми столбцами, HEK293T – отмечены темными столбцами. Пооси абцисс приведены названия плазмид, трансфецированных в клетки.Относительная теломеразная активность приведена по отношению к нетрансфецированным клеткам.70Известно, что большинство ученых для исследования ингибированиятеломеразы используют клеточный S100 экстракт, так как получать его легко ибыстро. Однако степень чистоты такого экстракта не подходит для измеренияингибирования теломеразы олигонуклеотидами.
Нами был разработан быстрыйметод очистки теломеразы, дающий необходимую для такого анализа степеньчистоты.РазработаннаяметодикаRQ-ТРАПсразбавлениемпозволяетколичественно измерять ингибирование теломеразы соединениями различнойприроды,включаяолигонуклеотидыивещества,непосредственновзаимодействующие с последовательностями теломерных повторов. Учитываяпростоту устранения ингибирования ПЦР, RQ-ТРАП с разбавлением подходитдля использования в скринингах ингибиторов теломераз.
Приемлемость RQТРАП с разбавлением была проверена сравнением работы известныхсоединений – ингибиторов теломеразы, этим методом и методом прямогоингибирования теломеразы. С помощью RQ-ТРАП метода были измереныингибирующие способности новых веществ.Мы впервые применили эписомальную репликацию, основанную наориджинерепликациивирусаEBV,длярекомбинантнойэкспрессиителомеразы. Это привело к повышению количества теломеразы в клетке иобогащению теломеразного экстракта. Введенные дополнительные стадииочистки клеточного экстракта центрифугированием через глицериновуюподушку и концентрирование теломеразного комплекса осаждением позволилиполучить обогащенный теломеразой экстракт и использовать его в методе RQТРАП с более высоким уровнем разбавления, что расширило возможностиметода, позволяя тестировать ингибирование теломеразы веществами, которыеингибируют ПЦР в наномолярных концентрациях.712.2.
Разработка новых подходов к ингибированию теломеразы2.2.1. Дизайн химерных бифункциональных олигонуклеотидовОсновной целью нашей работы была разработка новых подходовингибирования теломеразы. Известно, что теломеразная РНК имеет два домена,связывающиеся с hTERT и необходимые для работа теломеразы: псевдоузел иCR4/CR5. Было показано, что теломераза не теряет свою активность приэкспрессии этих доменов отдельно друг от друга [164]. Также известно, что вусловиях in vitro теломераза является димером, и эта димеризация,предположительно, необходима для работы теломеразы [62].
Существуетработа, в которой с помощью УФ сшивания показали, что два домена,псевдоузел и CR4/CR5, сближаются друг с другом в теломеразном комплексе[165]. Сближение может дать возможность кросс связыванию доменов черезобъединенные комплементарные этим доменам олигонуклеотиды. В связи сэтим мы решили разработать химерные олигонуклеотиды, состоящие из двухолигонуклеотидных частей, соединенных не нуклеотидным линкером. Этотхимерный олигонуклеотид связывался бы одновременно с двумя участкамиhTR внутримолекулярно и/или межмолекулярно. Такое связывание, возможно,нарушило бы структуру или динамику hTR и/или теломеразного комплекса(рис. 31), что привело бы к ингибированию теломеразы.72Рис. 31.
Общая схема представления предпологаемого механизмаингибирования теломеразы химерными олигонуклеотидами. Синей стрелкойотмечен олигонуклеотид, комплементарный к участку hTR. Волнистая синяялиния является линкером связывающий два олигонуклеотида. hTERT отмеченкак серый овал. 1. ингибирование внутримолекулярное, 2. межмолекулярное.Химерные олигонуклеотиды были составлены из следующих частей: М –олигонуклеотид комплементарный к матричной части (hTR область 46-65); J(hTR область 152-168) – комплементарен к одноцепочечной части псевдоузла;N – является комплементарным к CR4/CR5 домену hTR (рис. 32A). Такжеолигонуклеотид N имеет дополнительные 3 нуклеотида на 5’-конце,предоставляющие возможность отделять два соединенных комплементарныхучастка в таких олигонуклеотидах, как MN или JN. Во избежание деградациинуклеазами и элонгации полимеразами все олигонуклеотиды были 2’-OMeмодифицированы и защищены с 3’-конца 6-аминогексанолом. Кроме тогомодификация 2’-ОМе не вызывает расщепление мишеней РНК-зой Н, т.е.элиминирует действие олигонуклеотида по антисенс механизму.73Рис.
32. A. Положение олигонуклеотидных частей химер на вторичнойструктуре hTR. Олигонуклеотиды M, J, G и N окрашены в серый цвет. Б.Схематическое представление химер.74Длины олигонуклеотидов составляют примерно 20 н.о. Это связано сограничениямисинтеза.ОлигонуклеотидМподобенолигонуклеотидуISIS24961, однако на 7 нуклеотидов больше с 5’-конца, чтобы обеспечитьпрочное взаймодействие. 5’- конец был выбран по причине того, что приразработке GRN163L (Иметелстат) коньюгата 5’-конец меньше мешалингибированию [64].Олигонуклеотид J, комплементарный к участку 168-152 hTR, был выбранпотому, что siРНК и shРНК к этому району hTR вызывали найбольшийбиологический эффект – ингибировали теломеразу и приводили к укорочениютеломер [137]. Кроме того, в системе in vivo на клеточных линиях HEK293Eолигонуклеотид J сильнее ингибировал теломеразу, чем олигонуклеотидимеющии последовательность Иметелстат (табл.
6), что свидетельствует о том,что участок 152-168 hTR наиболее доступен в клетке.Химерные олигонуклеотиды были соединены 3’-5’, или 3’-3’, или 5’-5’концами через 1,3-пропандиоловый линкер (c3) (Рис. 32Б). Если M, N, Jолигонуклеотиды использовались индивидуально, то c3 линкер был добавленна 5’-конец, а в случае с М также и на 3’-конец. Олигонуклеотид G (Рис. 32A)(hTR область 42-54), который имеет последовательность, идентичную сGRN163L и связывается с матричной частью hTR, несет модификации,описанные выше, и был использован в качестве контроля для ингибированиятеломеразы.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
