Ингибирование теломеразы человека (1105569), страница 10
Текст из файла (страница 10)
Все последовательности протестированных олигонуклеотидовпредставлены в табл. 6. Для каждого была измерена теломеразная активностькак in vitro, так и в in vivo условиях. Примеры начальных графиков даны вприложении.75Табл. 6.Последовательности и количественные характеристики ингибированиятеломеразы олигонуклеотидами.олигонуклеотид\химерс3Nс3Mс3Jс3GMc3Mc3NMNc3с3MNM*c3NMc3N*c3Mc3NNc3MNc3JN*c3JПоследовательность 2’-O-метилолигонуклеотидов,позиция комплементарного участка hTRC3-GUUGCCCCGGGCCGACCGCG-NH2272-256C3-CCCUUCUCAGUUAGGGUUAG-NH265-46C3-UUGCUCUAGAAUGAACG-NH2168-152C3-UAGGGUUAGACAA-NH254-42CCCUUCUCAGUUAGGGUUAG-C365-46CCCUUCUCAGUUAGGGUUAG-C3GUUGCCCCGGGCCGACCGCG-NH265-46&272-256CCCUUCUCAGUUAGGGUUAGGUUGCCCCGGGCCGACCGCG –C365-46-272-256С3-CCCUUCUCAGUUAGGGUUAGGUUGCCCCGGGCCGACCGCG –NH265-46-272-256(3'-NH2-GAUUGGGAUUGACUCUUCCC-5')-C3GUUGCCCCGGGCCGACCGCG-NH246-65&272-256CCCUUCUCAGUUAGGGUUAG-C3-(3'GCGCCAGCCGGGCCCCGUUG-5’)65-46&256-272C3-CCCUUCUCAGUUAGGGUUAG-C3GUUGCCCCGGGCCGACCGCG-NH265-46&272-256GUUGCCCCGGGCCGACCGCG -C3CCCUUCUCAGUUAGGGUUAG-NH2256-272&46-65GUUGCCCCGGGCCGACCGCG -C3UUGCUCUAGAAUGAACG-NH2272-256&168-152(3’-NH2-GCGCCAGCCGGGCCCCGUUG-5’)-C3UUGCUCUAGAAUGAACG-NH2IC50,нMin vitroin vivoне ингиб.41.1±7.4100±205.2±0.919±166.8±0,8*11.6±5.65.5±0,6*75±5777.4±10*43±2167±33175±13735±18118±20*2.2±0.8не ингиб.18.4±5.6не ингиб.1.2±0.415.7±8.272±8*0.51±0.1113.5±3.47±1184±580.7±0.576±2127±3*1.3±0.9не ингиб.1.5±0.7не ингиб.1.3±0.676Jc3NNmisc3JNc3JmisNmisc3JmiscompNc3JMc3MM*c3MMMc3c3Mc3M256-272&168-152UUGCUCUAGAAUGAACG –C3GUUGCCCCGGGCCGACCGCG-NH2168-152&272-256GUUCGCCCGCGCCGACGCCG-C3UUGCUCUAGAAUGAACG-NH2272-256&168-152GUUGCCCCGGGCCGACCGCG -C3UUGUCCUAAGAUGACAG-NH2272-256&168-152GUUCGCCCGCGCCGACGCCG-C3UUGUCCUAAGAUGACAG-NH2272-256&168-152CGCGGUCGGCCGCCGGCAAC-C3CGUUCAUUCUAGAGCAA-NH2256-272(complem)& 152-168 (complem)CCCUUCUCAGUUAGGGUUAG-C3CCCUUCUCAGUUAGGGUUAG-NH265-46&65-46(3'-NH2-GAUUGGGAUUGACUCUUCCC-5')-C3CCCUUCUCAGUUAGGGUUAG-NH246-65&65-46CCCUUCUCAGUUAGGGUUAGCCCUUCUCAGUUAGGGUUAG-C365-46-65-46C3-CCCUUCUCAGUUAGGGUUAG-C3CCCUUCUCAGUUAGGGUUAG-NH265-46&65-46229±723.9±1.7не ингиб.8.5±3.5не ингиб.11.2±0.8не ингиб.18.4±3.2не ингиб.
не ингиб.221±101.4±0.311.9±0.319.3±2.5*0.3±0.142±126.7±3*4.5±0.944±120.31±0.04*-IC50 из прямого теломеразного метода, в остальных случаях IC50 определенс помощью RQ-ТРАП.не ингиб.-IC50 больше, чем 500нM.2.2.2. Ингибирование теломеразы химерными олигонуклеотидами invitroДля каждого олигонуклеотида при каждом измерении было проведенопараллельное тестирование влияния на ПЦР реакцию. Влияние на ПЦРпроверяли добавлением ингибиторных олигонуклеотидов после проведения77теломеразной реакции.
При этом если олигонуклеотид ингибирует ПЦР, тосигнал по сравнению с контролем, в котором отсутствует олигонуклеотид,будет ниже. ОлигонуклеотидыМ иJ по отдельности достаточно хорошоингибируют теломеразу in vitro (IC50 100 нM и 19 нM, соответственно). Как ипредполагалось, олигонуклеотид G показал лучшее ингибирование чем М (IC5011nM) (табл. 6).При сравнении ингибирующей способности Mc3M и M*c3M видноусиление ингибирования в 10-20 раз при инверсии олигонуклеотида М.
Этотэффект можно объяснить внутримолекулярным взаимодействием с 3’-концадвух конъюгированных М олигонуклеотидов с димерной формой теломеразы.В случае олигонуклеотида М расположение модификации с3 как на 5’-, так и на3’-концах не влияет на ингибирование теломеразы (табл. 6). Дополнительнымдоказательством может служить разница в ингибировании Мс3М и с3М (илиМс3). Олигонуклеотиды с3М и Мс3 могут взаимодействовать по отдельности сдвумя субьединицами димерной теломеразы, тогда как в олигонуклеотидеМс3М 5’-конец Мс3 части пространственно будет мешать связыванию 3’-концас3М части с одной из субьединиц теломеразы.
Из-за этого Мс3М ингибируеттеломеразу хуже (IC50=220нМ), чем Мс3 в отдельности (IC50~75нМ), а M*c3Mингибирует лучше (IC50~10нМ) (рис. 33).Олигонуклеотид N в системе in vitro не ингибирует теломеразу (табл. 6).Однако при конъюгировании олигонуклеотидов N и М, ингибирующаяспособность таких химерных олигонуклеотидов становится больше, чемолигонуклеотида М в отдельности. Например, химера Mc3N в два раза лучшеингибирует теломеразу, чем с3М, тогда как M*c3N и Mc3N* ингибируют в 5раз лучше. Такой эффект увеличения ингибирующей способности можнообъяснить за счет внутримолекулярного взаимодействия. Например, в активномтеломеразном комплексе домен CR4/CR5 hTR связан с белком hTERT, и это78взаимодействие сильнее, чем межмолекулярное взаимодействие CR4/CR5домена с олигонуклеотидом N.
Однако, в химере M с N, с теломеразой сначалавзаимодействуетолигонуклеотидМ.Всвязисчемвзаимодействиеолигонуклеотида N с доменом CR4/CR5 hTR становится внутримолекулярными может пересилить взаимодействие hTERT с доменом CR4/CR5. По сравнениюс химерой М и М, в химере М с N нет корреляции положения и ориентацииолигонуклеотида N с ингибирующей способностью теломеразы. Возможныепричины – это умение взаимодействовать олигонуклеотида N с обоимидоменами CR4/CR5 hTR в димерной форме теломеразы и/или высокаяконформационнаяподвижностьдоменаCR4/CR5hTRвактивномтеломеразном комплексе.Рис.33.Схематическоепредставление,объясняющееразницуингибировании теломеразы олигонуклеотидами с3М, Мс3, Мс3М и М*с3М.в79Былисинтезированыхимерныеолигонуклеотидысостоящиеизолигонуклеотидов J и N.
Такие химерные олигонуклеотиды интересны тем, чтоне содержат частей, комплементарных к матричной части hTR, и не имеюттеломерной последовательности. Олигонуклеотид J в отдельности сильноингибирует теломеразу, почти на уровне олигонуклеотида G. Однако приконъюгировании с N ингибирующая способность сильно уменьшается илиполностью теряется (табл. 6). Единственным объяснением может бытьпространственноезатруднениевзаимодействияолигонуклеотидаJстеломеразным комплексом в J и N химерах. Для проверки правильностиданных полученных методом ТРАП, для некоторых олигонуклеотидов былдополнительно сделан анализ прямым теломеразным методом (рис.
34).Полученные данные двумя разными методами данные согласуются друг сдругом.2.2.3. Ингибирование теломеразы химерными олигонуклеотидами in vivoУчитывая что олигонуклеотидные части химер могут мешать сборкетеломераз, мы изучили их влияние на теломеразную активность в условиях invivo на клеточной линий. Для этого клетки HEK293 были трансфецированыэтими олигонуклеотидами и культивированы в течение двух дней. Затемтеломеразная активность полученных клеточных экстрактов была измеренаметодом RQ-ТРАП. Полученные данные приведены в табл. 6. Примерыначальных графиков даны в приложении 2.80Рис. 34.
Измерение ингибирования теломеразы олигонуклеотидами прямым методом измерениятеломеразной активности. Числа с правой стороны означают количество добавленных нуклеотидов. Числарасположенные сверху геля означают концентрацию олигонуклеотидов (в нМ). Positive – теломеразная активностьв отсутствие ингибитора. RNAse – теломераза, обработанная РНК-зой А (2мг/мл в образце). 15bpLC – внутреннийконтроль нанесения, использованный при количественной оценке.81В условиях in vivo получены отличные от in vitro данные ингибированиятеломеразы выбранными олигонуклеотидами.
Причиной является то, чтотеломеразная РНК hTR в клетке встречается как в составе активноготеломеразного комплекса, так и в свободном виде. Кроме того, свободная hTRучаствует в образовании активной теломеразы. Следовательно, из-за влиянияингибиторов на биогенез теломеразы в условиях in vivo нет возможностисделать какие-то выводы о взаимосвязи между ингибирующей способностиолигонуклеотидов и структурным расположением теломеразных компонентов,как это было сделано для данных in vitro.
В системе in vivo ингибированиетеломеразы зависит от стабильности олигонуклеотидов и ингибированиябиогенеза, которые рассмотрены в дальнейших разделах. Кроме этого,необходимо исключить возможность ингибирования ПЦР амплификациисигнала в in vivo ТРАП.2.2.3.1. Проверка ингибирования ПЦР реакции для in vivo ТРАП методаХорошо известно, что ингибиторы теломеразы могут также ингибироватьшаг ПЦР в ТРАП in vitro [40,41]. Однако на данный момент отсутствуютработы, в которых проверялось бы ингибирование ПЦР для метода ТРАП invivo.
Существует предположение, что олигонуклеотиды могут адсорбироватьсяна поверхности цитоплазматической мембраны, не проникая внутрь клетки,совыделяться с теломеразой и ингибировать теломеразу при дальнейшейпостановке ТРАП [166]. Контроль, проверяющий ингибирование ПЦР в случаес in vitro ТРАП не подходит, т.к. такой контроль не учитывает in vivo процессы.Например, олигонуклеотид может деградировать в клетке и в последующем неингибировать ПЦР. В связи с этим мы разработали новый метод проверкиингибирования ПЦР для in vivo ТРАП, основанный на принципе метода82добавок в аналитической химии [167]. При такой проверке после лизированияклеток и получения клеточных экстрактов другая очищенная теломераза в 20-икратном избытке дополнительно добавляется в теломеразную реакцию.
![](https://s.studizba.com/z.php?f=/templates/si/i/noavatar.png&w=100&h=100&t=1"){kind=avatar}
